新型噻唑类芳香烃受体活性物质的合成表征与活性评价_.docx

摘要二恶英类物质是斯德哥尔摩公约中禁用的12种持久性有机污染物之一，在环境中广泛分布并持续存在。工业生产和垃圾焚烧是二恶英类物质产生的主要途径，由于其具有极高的结构稳定性和生物累积放大效应，目前在土壤、水体和大气等自然环境中广泛检出，由于其具有较高的脂溶性可富集于食物链上游的动物和人体内，并与多种不良健康效应有潜在关联。其中2,3,7,8-四氯二苯并p-二恶英（2,3,7,8-TCDD）是毒性最强的同系物，已被国际癌症研究中心列为人类一级致癌物。食物是人体暴露二恶英类化合物的主要途径。随着我国居民膳食结构的改变，二恶英污染风险较高的肉、蛋、奶等动源性饮食比重的增加使得国民暴露二恶英的几率大大增加。由于二恶英类物质难降解，生物累积性强，即便从污染源着手降低暴露风险，既往暴露的效应仍会长效存在。在分子层面上，二恶英类污染物致毒的机理主要是通过激活细胞内二恶英受体（芳香燃受体，AhR）以及下游的信号通路而产生。因此，通过适当调节芳香煌受体信号通路的应激反应有助于阻断其致毒效应。以五元睡噗杂环为母核进行不同取代基团的修饰可以得到一系列具有广谱生物活性的化合物。这类化合物具有高效、低毒等特点，在农药领域已经成为替代传统高毒性，非环境友好型农药的有效替代物；医药领域中，第四代头袍类药物中就有4种以睡哇杂环为核心的衍生药物。伴随着对其结构的不断衍生和利用，4-噬喋类杂环化合物在治疗癌症方面的活性也逐渐被挖掘出来，并有多项研究针对其中的活性化合物的抗癌信号通路进行阐述。睡噗类化合物广泛的应用为从其中筛选芳香始受体活性物质提供了基础。前期本研究组利用组合化学方法在相关药理研究基础上建立一个包含285种化合物的4曝嗖烷酮类化合物库。之后应用基于AhR的报告基因高通量生物活性筛选体系获得具有AhR拮抗效应的10种化合物,其中具有拮抗作用的281、282两种化合物表现出与经典AhR拮抗剂CH223191相类似的活性结果。为了进一步开发具有高生物安全和有效性的新型喷哇类AhR活性物质，本研究在前期实验结果基础上开发了化合物286、287,从AhR信号通路活性验证和对二恶英的细胞作用以及细胞毒性去评估和验证这4种新型嘎喋类AhR活性物质的应用价值。希望获得有效、安全的、可以对抗二恶英毒性的AhR活性化合物，能够成为一种有用的治疗剂和/或一种独特的先导化合物。本研究开展了以下三个方面的研究并得到结果如下：1）新型睡哇类AhR活性化合物设计、合成与表征。依据前期研究结果和组合化学方法，优化3-N位置的噬咏杂环修饰合成路线，我们重新设计并合成了先前报道的两种已知结构的AhR活性化合物281,282,并改变部分取代基结构合成II结构新颖的286,287化合物，通过高分辨质谱对其分子量进行确认；核磁氢谱确认其结构正确性。2）新型睡睫类化合物的AhR活性检测。合成的新型睡噗类AhR活性物质在细胞内不具有内源AhR激动剂活性，并与AhR稳定结合。对TCDD暴露导致的细胞死亡、细胞形态改变具有一定的缓解作用；在基因层面发现这4种脸喋类AhR活性物质具有较好的阻断TCDD诱导激活AhR下游基因转录的能力，而在蛋白水平，CYPlAkCYPlA2的蛋白表达并未有明显的改变。3）新型睡喋类化合物的细胞安全性评估。针对合成所得4种化合物，结合AhR标准拮抗剂CH223191分别在HepG2细胞中进行细胞活性检测，及可能引起细胞毒性的活性氧机制进行了初步探索，结果表明，化合物281、282、286、287在24h、48h时无明显细胞毒性，化合物282,286在72h的孵育下具有轻微的细胞毒效应。虽然4种化合物在24h无明显的细胞毒性，但281、286、287表现出轻微的RoS水平上升。通过本研究结果可以看到，化合物282表现出较好的抑制内源性配体激活AhR作用，化合物286表现出较好的抑制外源性配体，如TCDD激活AhR信号通路作用。关键词：睡唾烷酮、芳香煌受体、代谢毒性、拮抗效应、分子机制AbstractDioxinsareoneofthe12persistentorganicpollutantsbannedundertheStockholmConventionandarewidelydistributedandpersistentintheenvironment.Industrialproductionandwasteincinerationarethemainpathwaysfortheproductionofdioxinlikesubstances,whicharewidelydetectedinthenaturalenvironmentsuchassoil,waterandatmosphereduetotheirhighstructuralstabilityandbio-accumulativeamplificationeffects,andcanbeenrichedinanimalsandhumansduetotheirhighlipidsolubility,andarepotentiallyassociatedwithavarietyofadversehealtheffects.Amongthem,2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(2,3,7,8-TCDD)isthemosttoxiccongenerandhasbeenclassifiedasahumanclassIcarcinogenbytheInternationalAgencyforResearchonCancer.Oralingestionistheprimaryrouteofhumanexposuretodioxin-likecompounds.WiththechangeindietarystructureofChineseresidents,theincreaseintheconsumptionofmeat,eggs,milkandotheranimalderivedfoodwithhigherconcentrationofdioxinshasgreatlyincreasedthehazardofnationaldioxinexposure.Becausedioxinsaredifficulttodegradeandeasytobioaccumulate,theirtoxiceffectswillremainlong-lastingevenifexposurerisksarereducedfromthesource.Atthemolecularlevel,themechanismofdioxin-likepollutanttoxicityismainlygeneratedthroughactivationofintracellulardioxinreceptor(ArylhydrocarbonReceptors,AhR)aswellasitsdownstreamsignalingpathways.Therefore,byappropriatelyregulatingtheoxidativestressresponsemediatedbyAhRcanblockitstoxicogeniceffects.Themodificationofthefive-memberedthiazoleheterocycleastheparentstructurewithdifferentsubstituentgroupscanleadtoaseriesofcompoundswithbroad-spectrumbiologicalactivities.Thesecompoundsarehighefficiencyandlowtoxicity,andhavebecomeaneffectivealternativetotraditionalhighlytoxicandnon-environmentallyfriendlypesticidesinthepesticidefield;therearefourthiazoleheterocyclic-deriveddrugsinthefourthgenerationofcephalosporinsinthepharmaceuticalfield.Alongwiththecontinuousderivationandutilizationofitsstructure,theactivityof4-thiazoleheterocycliccompoundsinthetreatmentofcancerhasstartedtobeexplored,andseveralstudieshavebeenconductedtoelucidatetheiranticancersignalingpathway.ThewiderangeofapplicationsofthiazolesprovidesthebasisforscreeningAhRactivatedsubstancesfromthem.Inthepreviousphase,ourgroupusedcombinatorialchemistrytobuildalibraryof4-thiazolidinonescontaining285compoundsbasedonrelevantpharmacologicalstudies.Subsequently,theAhR-basedreportergenehigh-throughputbioactivityscreeningsystemwasappliedtoobtain10compoundswithAhRantagonisticeffects,ofwhichtwocompoundswithantagonisticeffects281and282showedsimilaractivityresultstothoseoftheclassicalAhRantagonistCH223191.InordertofurtherdevelopnovelthiazoleAhRactivesubstanceswithhighbiosafetyandefficacy,compounds286and287weredevelopedbasedontheresultsofpreviousexperimentstoevaluateandverifytheapplicationvalueofthesefournovelthiazoleAhRactivesubstancesfromtheverificationofAhRsignalingpathwayactivityandcelleffectondioxinsandcytotoxicity.Itishopedthateffective,safeAhRactivecompoundsthatcancombatdioxintoxicitycanbeausefultherapeuticagentand/orauniqueleadcompound.Thisresearchcontainsthefollowingthreemainaspects：1) Design,synthesisandcharacterizationofnovelthiazoleAhRactivecompounds.Basedontheresultsofpreviousstudiesandcombinatorialchemistry,weoptimizedthesyntheticrouteofthiazoleheterocyc