土霉素钙预混剂效价检验操作.docx
土霉素钙预混剂效价检验操作规程4.8效价测定4.8.1.器具4.8.1.1.操作室光线明亮，操作室分为两部分，彼此分开；一部分为一般操作间，一部分效价测定操作间。操作间内设有达到空气消毒的紫外线灯；装有空调设备，控制室温20-25；操作台应稳固，台面用玻璃板垫平，用水平仪校准,保持水平。室内应避免抗生素的污染。4.8.1.2.双碟为硬质玻璃，深16-17mm,内径约90mm,碟底表面要求平坦，厚薄均匀无凹凸现象。用过的双碟经0llMpa、121°C30min高压蒸汽灭菌后用水冲洗,刷洗干净，再用蒸馈水清洗三次，晾干。将双碟盛于适宜容器内在150-160°C干热灭菌2小时或高压121°C蒸汽灭菌30min,备用。4.8.1.3.陶瓦盖内径约103mm,外径约108mm,平坦，吸水性强，应定期清洗，干燥。4.8.L4.钢管外径(8.0±0.1)或(7.8±0.1)mm,内径(6.0±0.1)mm和高(10±0.1)mm,每套钢管重量差异不得超过±0.05g,钢管内外壁及两端面光洁平坦,管壁厚薄一致.每次使用后先经0.11MPa、121°C30min高压蒸汽灭菌用水冲洗干净后，再用洗衣粉水在超声波中清洗30min,用水冲洗再用蒸储水冲洗二次，并在电炉上煮沸几分钟，晾干，在160165°C干热灭菌2h以上备用。检查方法：用游标卡尺从不同的位置测量外径,内径及高度是否符合要求。4.8.1.5.钢管放置器置于效价测定操作间内，钢管放置器为防止抗生素污染，应定期用75%的酒精棉擦拭，并用酒精棉火焰烧小孔。4.8.1.6.锻子夹钢管用。夹钢管后，用水清洗，再用蒸储水冲洗3次,置适宜容器内在160165°C干热灭菌2h。4.8.1.7.恒温培养箱隔水式为宜，3537°C及2627°C,隔板上可备有带孔玻璃板并垫平。4.8.1.8.灭菌刻度吸管吸取菌液及培养基用。实验用后应立即置5%石碳酸或1：1000新洁尔灭溶液中消毒后，再按玻璃容器常规洗涤，晾干。置适宜容器中160以上干热灭菌2h或121蒸汽灭菌30min烘干备用。4.8.1.9.玻璃容器包括移液管、刻度吸管及容量瓶等按“玻璃器皿检定规程”进行标定，要符合一等品规定，每次应用前用清洁液浸泡，水冲洗，纯化水冲洗三次,淋干。4.8.1.10.称量管用毕先用水冲洗淋干，置清洁液中浸泡2小时以上，自来水冲洗、蒸偏水冲洗三次，置于干燥器中备用。4.8.1.11.电热恒温干燥箱室温+10°C250°C4.8.1.12.恒温水浴锅37°C100°C4.8.1.13.抑菌圈测定仪仪器必须定期按抑菌圈测定仪检验规程进行自校符合规定方能使用。4.8.1.14.分析天平天平感量O.Img4.8.2.方法管碟法4.8.2.1指示菌:藤黄微球菌4.8.2.1.1藤黄微球菌（28001）菌液制备在测定样品前12天,从冰箱中取出传代用的母种（母种每月传代一次）.放置室温片刻后,于甲酚皂液消毒和紫外灯消毒30分钟以上的洁净工作室内，按无菌操作，在火焰旁,接种在另一支斜面培养基上,置2627的恒温培养箱中.培养24小时,取出在洁净室内，按无菌操作用灭菌过的培养基IH或0.9%的灭菌氯化钠溶液将斜面菌苔洗下,制成悬浮液.置28的冰箱中备用，保存期为一个月。4.8.2.1.2平InL培养基制备采用抗生素检定培养基II号，PH6.56.6.称取抗生素检定培养基H号27.0g,溶解于1000ml蒸馄水中，用6.0molL氢氧化钠H或lmolL盐酸调节PH,PH略高0.20.4,使消后的PH为6.56.6.然后分装于三角瓶内，用棉塞、牛皮纸、细绳子包扎好，放置压力蒸汽消毒器内，121蒸汽灭菌30分钟,待消毒完毕,冷却至60左右,取出.再取少许倒入平皿,凝固后于36±1恒温箱内,恒温培养2天后，肉眼检查无杂菌后备用.有效期限为15天。4.8.2.1.3指示菌（28001）斜面培养基制备称取营养琼脂32.Og于1000ml蒸馈水中，用6.0mol/LNaOH调节PH,PH略高0.20.4,使消后的PH为7.07.2.然后分装于茄子瓶和试管内，用棉塞、牛皮纸、细绳子包扎好，放置于压力蒸汽消毒器内，121蒸汽灭菌30分钟，待消毒完毕，冷却至60左右，取出，摇匀铺成斜面。凝固后取少许于36±1°C恒温箱内，恒温培养2天后，肉眼检查无杂菌，放入冰箱备用。有效期为一个月。4.8.2.1.4PH6.0缓冲溶液主要成份及各称:磷酸氢二钾:2g；磷酸二氢钾:8g；加水使成1000nI1,滤过，分装，121蒸汽灭菌30分钟。有效期为20天。4.8.2.1.5无菌水的制备将蒸储水分别分装于三角瓶和试管中，用棉塞、牛皮纸、细绳子包扎好，121°C蒸汽灭菌30分钟.有效期为20天。4.8.2.2操作步骤4.8.2.2.1精确称取土霉素标准品适量于50ml烧杯中（使之配成1000uml）,加2%草酸溶液适量使PH值至1.52.0,重复搅拌，暗处放置45min后完全移入到50ml容量瓶中，加灭菌水定量制成每Iml中约含1000单位的溶液，静置，封好置5以下冰箱中备用（此标准品储备液使用期限为：7天）。使用时将标准液放至室温,再用缓冲溶液稀释成每ml含10-40单位的土霉素溶液。样品的前处理：根据样品的估计效价，精密称取适量，加2%草酸溶液适量使PH值至1.52.0,重复搅拌，暗处放置45min后加灭菌水定量制成每Iml中约含1000单位的溶液，静置，取上清液。即得供试品溶液，备用。4.8.2.2.2称样量的计算：W=V×CP式中：W：为需标准品或供试品的重量（mg）；V：为溶解标准品或供试品制成浓溶液时所用容量瓶的体积量（ml）；C：为标准品或供试品溶液的浓度（uml或ug/ml）；P：为标准品的纯度或供试品的规定效价（uml或ug/ml）。4.8.2.2.3稀释：标准品与供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2ml为宜，稀释步骤一般不超过3步第一步取10.OmI（1000U/ml）-50ml容量瓶-200uml第二步取5.0ml（200uml）-5OnIl容量瓶-20uml取5.Oml（200uml）-IOOml容量瓶-10uml4.8.2.2.3双碟的制备4.8.2.2.3.1倒下层根据样品的数量,计算底层培养基的用量,将5.4.2.1.2所述培养基加热融化稍冷,用无菌的大单位刻度吸管分别注入融化的培养基1820ml于无菌的平底双碟内均匀摊布,放置水平台面上使之凝固。4.8.2.2.3.2倒上层根据样品的数量,计算菌层培养基的用量,将5.4.2.1.2所述培养基加热融化后,稍冷置于48±2°C水浴内，保温,按已试验妥的菌量加入制备的菌液,并回转三角瓶使之充分混匀,用无菌吸管取5ml加入已凝固的底层培养基上立即旋转摇匀,使其均匀摊布,静置约15分钟左右待凝固备用。4.8.2.2.3.3每批样品取双碟六只，每碟安放小钢管6只将已制备好的标准液和检品液分别间隔滴入小钢管中（见图），每只盖上干燥的陶瓷瓦盖,置36±1°C恒温箱培养1618小时。标准液（HJ单位$2_检品液身单位丁2检品液低单位TlLoC）标准液低单位Sl4.8.2.2.3.4抑菌圈测量V-Jj将培养好的双碟取出，能盖上玻盖，按编号排好次序，用抑菌圈测量仪,测量抑菌圈的直径（抑菌圈直径应在18-22mm为宜），并记录其数值。4.8.2.2.3.5计算公式第一碟：S1S2T1T2第二碟：S1S2T1T2第三碟：S1S2T1T2第四碟：S1S2T1T2第五碟：S1S2T1T2第六碟：SiS2T1T2计算s2S1T2v=(2+1)-(w=(2+s2)-(T1S2+S1)1+s1)式中：ZSz=高浓度标准液所致的各抑菌直径的总和；S尸低浓度标准液所致的各抑菌圈直径的总和；2T?二高浓度检品液所致的各抑菌圈直径的总和；ZT尸低浓度检品液所致的各种抑菌圈直径的总和。将上式求得V和W值代入以下公式计算其生物含量：含量%=Zg*EXo301）X1OO效价u/mg=含量%X估计效价（或称供试品效价标示量）可信限率不大于5%。4.8.3菌种的保存检定用菌种由专人保管,保存在28的冰箱内，并作上标记。
