大豆分离蛋白胶骨粘合强度的测定及对成骨细胞生长的影响.docx

大豆分离蛋白胶骨粘合强度的测定及对成骨细胞生长的影响摘要：以骨粘合强度为指标，研究了大豆分离蛋白(Soybeanproteinisolate,SPI)胶的浓度对猪扇骨粘合强度的影响，并通过MTT细胞毒性实验研究了大豆分离蛋白胶对成骨细胞(MC3T3-ED生长的影响，通过细胞贴壁率实验研究了大豆分离蛋白胶对成骨细胞贴壁率的影响。结果表明：大豆分离蛋白胶的浓度越高，骨粘合强度越大(p<0.05).在24h和48h的培养条件下，大豆分离蛋白对成骨细胞的生长情况没有影响(p>0.05),并且大豆分离蛋白胶对成骨细胞贴壁率没有影响(p>0.05)o本研究结果表明SPl胶具有潜在的医用黏合剂的应用价值。关键词：大豆分离蛋白(SPI);骨粘合强度；成骨细胞Abstract:Thepurposeofthisstudywastoexploretheinfluenceofconcentrationontheadhesivestrengthofsoybeanproteinisolate(SPI)ontoporcinebones.TheeffectsofSPIonthegrowthandthecelladhterentrateofosteoblasts(MC3T3-E1)weretestedbyMTTcytotoxicitytestandcelladhterentratetest.TheresultsshowedthatthetensilebondstrengthofSPIadhesiveincreasedwiththeincreaseofitsconcentration(KO.05).SPIshowednotoxicitytoosteoblastswhenexposedfor24and48hrsincubation(p<0.05).Moreover,SPIadhesiveshowednosignificanteffectsonthecelladhterentrateofosteoblasts(p>0.05),suggestingthatSPIhasapotentialtobeutilizedasanadhesiveinmedicalfields.Keywords:Soyproteinisolate(SPI);Bonebonding;Osteoblasts目录前言51实验材料与方法错误!未定义书签。1.1实验材料41.1.1实验试剂41.1.2实验仪器错误!未定义书签。1.2实验方法错误!未定义书签。1.2. 1大豆分离蛋白胶的制备51.2. 1.1脱脂大豆粉的制备51.3. 1.2大豆分离蛋白的制备51.4. 1.3大豆分离蛋白胶的制备101.2.2 骨片的制备101.2.3 粘合强度测定错误!未定义书签。1.2.4 不同浓度下大豆分离蛋白胶骨粘合强度的测定111.2.5 大豆分离蛋白胶对成骨细胞生长影响的测定错误!未定义书签。1. 2.5.1MTT细胞生长的测定71.2.5.2细胞贴壁率的测定121.2.6数理统计分析错误!未定义书签。2结果与分析82.1浓度对大豆分离蛋白胶骨粘合强度的影响82.2大豆分离蛋白胶对成骨细胞生长的影响92.3大豆分离蛋白对成骨细胞贴壁率的影响103结论154展望错误!未定义书签。致谢17参考文献18前言大豆是生活中常见的食物，含有丰富的营养物质，包括多种必需氨基酸（人体需要但人体不能合成，只能通过食物来摄取），此外还含有25%的脂肪，是重要的油料作物。大豆分离蛋白（SPl）是由大豆蛋白深加工得到的副产物，经测定，大豆分离蛋白中的蛋白质含量高达90%,因此被称为高纯度大豆蛋白质。大豆分离蛋白的制备工艺简单易行，以低温大豆粕为原料，通过碱溶酸沉方法制备。大豆在我国的种植面积大，范围广，因此是一种优质又廉价的资源。大豆分离蛋白作为植物蛋白中为数不多的优质蛋白质，当人体在不宜过多摄入动物蛋白质的情况下可以通过摄入大豆蛋白来代替。大豆分离蛋白在行业的应用十分广泛，多应用于食品领域。大豆分离蛋白具有低脂肪含量的优点，因此可以加工成为优质蛋白粉供特殊人群使用，甚至可以作为航空航天食品应用于国防领域。同时，大豆分离蛋白也可以作为营养强化剂应用于保健食品领域，其功效诸多，如减少骨质疏松、阻止尿钙流失，以及降低人体血液中低密度脂蛋白胆固醇以及总胆固醇的含量。除用作食品添加剂外，大豆分离蛋白因其良好的起泡性、乳化性、溶解性，凝胶性等功能特性，在材料学领域广受青睐（如表1）。表1大豆分离蛋白在材料学领域应用Table1soyproteinisolateapplicationsinthefieldofmaterialsscience年份机构胶黏剂应用1923年Johnson等人以脱脂大豆粉为基料的胶粘剂仅适用于胶合板工业。Kuo等人用70%的豆粉和30%的酚醛混合制成胶粘剂用于胶合板生产，其性能接近商业酚醛胶的胶合板。1930年美国杜邦大豆蛋白腺醛脂用于木板的胶黏，但因生产成公司胶黏剂本高未能大量使用。2001年美国Soypolymerpro-cote大豆聚合物（多功应用于涂料、胶合板的粘结等公司能化学改性大豆分离蛋白）多种领域。Boyer等人用缓慢冷冻和融化的方法来生产植物蛋白胶粘剂应用于纺织、纸箱包装及水基涂料等行业口，大豆蛋白质来源于植物，可以避免动物传染性疾病，其降解产物无毒副作用，对细胞增殖和组织再生具有促进作用，所以大豆分离蛋白可以作为生物材料。例如，大豆分离蛋白可以制作为大豆蛋白质/甲壳素复合膜，具有良好的生物相容性、透气性、抗菌性，可应用于伤口敷料或皮肤组织工程材料皿。其还可以制作为大豆分离蛋白/聚乙二醇水凝胶，有利于皮肤创面体液的吸收和创面的愈合，可应用于组织工程领域的支架材料其还可以制作为纤维素/大豆蛋白质复合膜，具有良好的组织相容性、适合多种细胞在其表面生长和繁殖，可应用于组织工程与再生医学领域的生物材料网。不仅如此,大豆分离蛋白水解物可以促进细胞生长，所以可以用作无血清培养基的成分之一或者添加剂虽然大豆分离蛋白胶在纺织、包装、木材、生物材料等领域已有诸多报道，但其作为新型生物粘合剂在医学领域的应用尚待研究。随着人们生活质量的日益提升，医用骨粘合剂已经成为临床医学的新宠，它的出现代替了传统治疗骨折的钢针、钢丝、丝线等固定，伤口缝线缝合，其不仅具备操作简单方便、稳定性高、不易感染、可任意塑造、使用量少、大大缩短手术时间等优点，而且能够克服手术外部固定和内部金属固定的沉重、复杂等问题询，尤其解决了粉碎性骨折中存在较小的碎骨片很难固定以及有可能造成机体肢体功能障碍等后遗症的问题（如果仅仅保持骨折的表面力线位置而单独靠机体自行愈合，会产生后遗症的问题因此,使用医用骨粘合剂对骨折中产生的碎块进行粘合、治疗恢复的方法得到普遍重视。此外,大豆蛋白粘合剂替代传统化学粘合剂如氯羟基丙酸酯类粘合剂，可以弥补其不易被机体吸收代谢、妨碍机体组织愈合、不符合绿色环保要求等缺点，而且，相较现有的新型生物粘合剂，如天然海洋生物类胶黏剂（贻贝蛋白粘合剂），大豆分离蛋白胶可以达到节约成本的目的"间。不仅如此，大豆分离蛋白胶具有原料来源广、良好的生物相容性、粘合强度大等优点。随着大豆蛋白胶黏技术的不断发展，大豆蛋白胶黏剂应用于医用胶黏剂领域将有更加广阔的前景。理想的医用骨粘合剂应具备以下条件：生物相容性良好；能够在生物体体内迅速粘合伤口；粘合强度大能够保持伤口的粘合状态以不被撕裂；对组织机体无毒，在生物体中能够被代谢降解；经济实用、操作简单方便。但是完全符合上述条件的医用粘合剂至今还未出现，所以研究出更加适合临床的新型医用骨粘合剂已经成为人们的需要。从天然的大豆分离蛋白制备的粘合剂有可能成为满足上述要求的新型医用骨粘合剂。成骨细胞株常常被作为细胞模型来研究骨代谢。这种细胞株具备碱性磷酸酶活性、基质矿化、一型胶原合成等生物学特性，具备作为体外培养成骨细胞的细胞株的良好条件，是国际公认的良好的体外培养成骨细胞株型。不仅如此，成骨细胞株的增殖在一定程度上反映了成骨细胞的增殖，成骨细胞的增殖有利于骨质形成，在骨代谢过程中占有重要地位加。本课题从上述理念出发，将制备得到的大豆分离蛋白作为粘合剂应用于动物骨骼粘合，以成骨细胞体外培养为模型，在评价大豆分离蛋白浓度对骨粘合强度的影响的同时,检测大豆分离蛋白胶对成骨细胞生长的影响, 粘合剂应用于临床医学。1实验材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验试剂含羞草黑大豆(市售)新鲜猪扇骨(市售)FBS、DEME-高糖、Penicillin-StreptomyciTrypsin EDTA(0. 05%)MTT异丙醇、NP-40、盐酸、氯化钠磷酸二氢钾、磷酸氢二钾氢氧化钠、PBS磷酸盐缓冲液乙醒氯化钙PBS磷酸盐缓冲液所有实验试剂均为分析纯1. 1.2实验仪器HY-0580微机控制电子万能材料试验机T504医疗电锯电钻组TG16-WS台式高速离心机以期将来能够将大豆分离蛋白胶作为医用产自江苏昆山 产自江苏徐州 (100×)GibCO 公司Gibco公司Sigama公司国药集团化学试剂有限公司 北京索莱宝科技有限公司 北京索莱宝科技有限公司上海生物工程股份有限公司国药集团化学试剂有限公司北京索莱宝科技有限公司上海横翼精密仪器有限公司天津市津东希冀医疗器械厂P-500-3微型 陕西施力特机电设备技术工程有限公司湖南湘仪实验室仪器开发有限公司H1850R高速冷冻离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司BCD-251 WBSV海尔冰箱THZ-C恒温振荡器PRACTUM224-1CN 电子天平98-2磁力搅拌器LRH-150生化培养箱DHC-P146A电热恒温鼓风干燥箱PHS-3E 0酸度计LS750液氮罐酶标仪生物安全柜、C02培养箱荧光倒置显微镜HH-2数显恒温水浴锅青岛海尔股份制有限公司苏州培英实验室仪器制备有限公司 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司上海司乐仪器有限公司 上海-恒科学仪器有限公司 上海-恒科学仪器有限公司 上海-恒科学仪器有限公司 北京天信德科技发展有限公司美国Bio Tek公司赛默飞世尔科技有限公司卡尔蔡司公司 常州国华电器有限公司德国赛多利斯公司PRACTUM224-1CN 电子天平1.2实验方法1.2.1 大豆分离蛋白胶的制备1.2. 1.1脱脂大豆粉的制备脱脂大豆粉的制备是参照陈振家如的方法，首先将大豆磨粉，然后将其过80目的 筛子，在25°C和IIOrmin的条件下，使其与脱脂溶剂乙醵按照1: 8(wv)的比例混合， 在恒温振荡器中均匀震摇8 h,取出，弃去上清液，保留下层试剂，将以上步骤重复三次并将脱脂豆粉风干，以作备用。1.2.1.2大豆分离蛋白的制备大豆分离蛋白的制备参照宋鹏的方法，将脱脂大豆粉在低温下储存，将其干燥30min,取50g,按照1：10将其与水进行一次碱提，调PH8.0,在40。C的条件下，搅拌25min,然后在3100g,4的条件下离心20min,取上清液并在30r/min的条件下将其酸沉，3100g,4的条件下离心5min,取沉淀(粗蛋白)水洗，将其调至PH7.0,将其冷冻干燥，即可制得大豆分离蛋白(SPI)o1.2. 1.3大豆分离蛋白胶的制备将冻干的SPl溶于0.01mol/LPBS缓冲液中，在室温下搅拌30m