人体益生菌阿克曼氏菌检测方法的开发.docx

摘要人体内的肠道微生物群在维持生理稳态中一直发挥着重要作用，为人类健康提供内部支持。其中目前对肠道微生物的检测手段除了有传统培养法、下一代测序技术(NGS)两种以外。目前.，这些研究方法中普遍存在着一些明显的缺陷，如操作步骤繁多、耗费时间长、准确率低下、研究成本高等问题。除了以上两种，还有荧光原位杂交(FISH)和实时荧光定量PCR两种方法。本文旨在开发出一种利用实时荧光定量PCR来定向检测阿克曼氏菌的方法，通过该方法可以快速高效地在低成本的条件下定向检测阿克曼氏菌的数量并加以分析，由此为阿克曼氏菌的深入研究提供更加高效的大量数据支持。为了设计出特异性强，灵敏度高的引物探针组合，先从NCBI数据库中检索阿克曼氏菌的全基因组数据。找到16SrRNA序列保守区，通过MEGA软件先将序列进行对齐，根据阿克曼氏菌的特征SNP位点设计特异性强的引物探针组合，然后送到上海生工进行合成。本实验所检测的是人肠道微生物阿克曼氏菌，样本均为人粪便样本，能更好的反映人的肠道微生物组成。通过粪便微生物DNA提取试剂盒QIAamPPowerFecalProDNAKit进行微生物基因组DNA提取，使用过验证合格的引物先进行普通PCR扩增检测，琼脂糖凝胶电泳验证后再用qPCR检测手段去验证是否符合实验要求。在HITdb数据库中选择目标菌种后，我们设计了具有特异性的引物和探针，并验证了靶向菌种的覆盖率超过70%o通过比较文献数据和实验验证，筛选出适用于TaqManqPCR的肠道微生物标记基因，建立标准曲线，实现对肠道微生物数量的快速定量。通过对不同样本的检测和比较，我们获得了检测结果的变异系数小于10%的证明，说明该方法具有很高的稳定性。我们将T叫ManqPCR方法检测结果与16srRNA测序结果进行了相关性分析，结果较为显著(p<0.05),验证了该方法的有效性。本研究根据Hrrdb数据库设计的靶向微生物群的引物和探针检测到的粪便样本中微生物的相对丰度结果与16SrRNA测序结果相吻合。该研究可以为各种微生物行业提供更高的效益，同时也为临床诊断制定治疗方案提供了快速有效的参考信息。关键词：肠道微生物群；阿克曼氏菌；琼脂糖凝胶电泳；实时荧光定量PCRAbstractTheintestinalmicrobiotainthehumanbodyplaysanimportantroleinmaintainingphysiologicalhomeostasisandprovidinginternalsupportforhumanhealth.Currently,therearetwocommonlyusedmethodsfordetectingintestinalmicrobiota:traditionalcultivationandnext-generationsequencing(NGS).However,thesemethodshavesomeobviousdefects,suchascomplexoperationsteps,longtimeconsumption,lowaccuracy,andhighresearchcosts.Inadditiontothesetwomethods,therearetwoothermethods:fluorescenceinsituhybridization(FISH)andreal-timefluorescencequantitativePCR.ThisarticleaimstodevelopamethodfortargeteddetectionofAkkermansiamuciniphilausingreal-timefluorescencequantitativePCR,whichcanquicklyandefficientlydetectandanalyzethenumberofAkkermansiamuciniphilaunderlow-costconditions.Thisprovidesmoreefficientandmassivedatasupportforthein-depthstudyofAkkermansiamuciniphila.Inordertodesignaprimerprobecombinationwithhighspecificityandsensitivity,thewhole-genomedataofAkkennansiamuciniphilawasretrievedfromtheNCBIdatabase.Theconservedregionofthe16SrRNAsequencewasfound,andthesequencewasalignedusingMEGAsoftware.BasedonthecharacteristicSNPsitesofAkkermansiamuciniphila,aprimerprobecombinationwithstrongspecificitywasdesignedandsynthesizedbyShanghaiBioengineering.Thesamplestestedinthisexperimentwerehumanfecalsamples,whichbetterreflectthecompositionofhumanintestinalmicrobiota.MicrobialgenomicDNAwasextractedusingtheQIAampPowerFecalProDNAKit,andthevalidatedprimerswerefirstusedforordinaryPCRamplificationdetection.Afterverificationbyagarosegelelectrophoresis,qPCRwasusedtoverifywhetheritmettheexperimentalrequirements.AfterselectingthetargetbacterialspeciesintheHITdbdatabase,wedesignedspecificprimersandprobes,andverifiedthatthecoverageofthetargetedbacterialspeciesexceeded70%.Bycomparingliteraturedataandexperimentalverification,wescreenedforintestinalmicrobialmarkergenessuitableforTaqManqPCR,establishedastandardcurve,andachievedrapidquantificationofintestinalmicrobialquantity.Bydetectingandcomparingdifferentsamples,Weobtainedproofthatthecoefficientofvariationofthedetectionresultswaslessthan10%,indicatingthatthismethodhashighstability.WeconductedacorrelationanalysisbetweentheTaqManqPCRdetectionresultsandthe16SrRNAsequencingresults,andtheresultsweresignificant(p<0.05),verifyingtheeffectivenessofthismethod.TherelativeabundanceofmicrobesinfecalsamplesdetectedbyprimersandprobestargetingmicrobialgroupsdesignedaccordingtotheHITdbdatabasewasconsistentwiththe16SrRNAsequencingresults.Thisstudycanprovidehigherefficiencyforvariousmicrobialindustries,andalsoprovidesrapidandeffectivereferenceinformationforclinicaldiagnosisandtreatmentplans.KeyWords：Intestinalmicrobiota;Akkermansiamuciniphila;Agarosegelelectrophoresis;Real-timefluorescencequantitativePCR摘要错误!未定义书签。AbstractI第一章文献综述11.1 肠道微生物群的组成11.2 阿克曼氏菌简介11.2.1 阿克曼氏菌与疾病的关系21.2.2 阿克曼氏菌与饮食的关系21.3 检测方法31.3.1 传统培养法31.3.2 高通量测序技术31.3.3 荧光原位杂交41.3.4 实时荧光定量PCR51.3.5 常用方法优缺点比较6第二章TaqManqPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌82.1 材料与设备82.1.1 材料来源82.1.2 主要设备92.2 实验方法102.2.1 样本的预处理102.2.2 DNA浓度检测102.2.3 琼脂糖凝胶电泳102.3 TaqManqPCR检测方法快速检测阿克曼氏菌实验112.3.1 靶标筛选112.3.2 TaqManqPCR检测方法的建立112.3.3 样本DNA提取112.3.4 阿克曼氏菌的TaqManqPCR检测122.3.5 质粒的建立13第三章结果与讨论153.1 引物和探针的设计结果错误!未定义书签。3.2 标准曲线与T叫ManqPCR方法的分析163.2.1 标准曲线的制作173.3 小结18第四章结论19参考文献20致谢22第一章文献综述1.1 肠道微生物群的组成人类微生物组计划(HMP)和人类肠道宏基因组学(MHlT)计划完成后，人们对自身携带的微生物有了清楚的了解。人体中寄居着数万亿微生物，它们的数量超过了人体细胞，二者之比为10：I0而且，人体内的微生物大部分寄居在肠道内，共有1000至2000种之多。因此在每个人的肠道中都有至少100多种细菌，还有一些数量和种类尚未弄清的病毒。它们对人类的生命功能和人体健康发挥着神奇的作用，因为它们具有调节代谢、营养、免疫和保护机体的功能。肠道微生物是一个庞大复杂的群体,种类达500Tooo种,细菌总数达100万亿，是人体自身细胞总数的10倍。人类肠道微生物群由无数微生物相互作用于人类宿主，所有肠道微生物基因的收集代表了一个遗传库，比人类基因组高一个数量级。在某种程度上，它也被认为是人体的“必需器官”。肠道菌群主要是由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成，其中厌氧菌占99%以上。人类肠道菌群已经鉴定出细菌的几十个门，包括厚壁菌门Firm!cutes')、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(PrOteobaCterid)、放线菌门(A历。teriay梭杆菌11(Fusobacteria)疣微菌门(Verrucoinicrobiay蓝藻细菌门(CyanobaCteria)和螺旋体门(SPiroehaeteS)等。其中厚壁菌门(主要为梭菌属；占所有细菌的50-70%),拟杆菌门(10-30%)变形菌门(/10%),和放线菌门(W5%)。其中最主要的是拟杆菌门和厚壁菌门，占据着超过98%的绝对优势。整个消化道内肠道微生物群的微生物组成各不相同。在胃和小消化道中，细菌种类相对较少。