最新急性髓系白血病微小残留病检测与临床解读中国专家共识.docx

最新急性髓系白血病微小残留病检测与临床解读中国专家共识急性髓系白血病（AML）是一种来源于造血干细胞的血液系统恶性疾病，以髓系来源的异常分化原始细胞克隆性扩增为特征，年龄60岁的患者长期生存率为35%45%,年龄60岁的患者长期生存率仅为10%-15%o白血病复发是提高AML疗效的主要瓶颈。国内外的研究表明微小残留病（MRD）检测不仅可用于疗效评估、复发预警，还可用于指导治疗方法的选择以及抢先干预。因此，MRD检测已成为降低白血病复发、提高疗效的关键环节之一。AML患者的MRD检测方法包括多参数流式细胞术（MFC）.实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）技术以及数字PCR（dd-PCR师二代测序技术NGS瘴其中dd-PCR和NGS尚处于临床研究阶段,未被常规用于MRD评估。目前,我国尚缺乏针对AML患者MRD检测以及如何将MRD检测结果应用于临床的指南或共识。为推动MRD在AML诊疗中的规范化应用、提高诊治水平，中华医学会血液学分会实验诊断学组组织国内AML诊疗领域的相关专家，结合国内外相关研究进展，制定了AML患者MRD检测与临床解读的中国专家共识。该共识包括：MRD的概念和检测方法、MFC和分子生物学方法检测MRD、检测结果的临床解读等部分，具体如下。一、MRD的概念和检测方法就AML而言，MRD是指初诊或难治/复发状态的患者经化疗、靶向治疗、嵌合抗原受体T细胞和（或）异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）早期复发- - - - - - - - -i 愈一治 MRDlj0评 MR呈诲 (de-ecsrze (Unde-ectaze MRD) MRS一100%crl*LrjLr5fr7rMrrl0l-k Oooooooooooo等治疗获得血液学完全缓解（CHR,骨髓涂片经瑞特-吉姆萨染色，光学显微镜检测原始细胞5%）后体内残存的少量白血病细胞。健康成人骨髓有核细胞数为（1013）×WVkg;一个体重70kg的患者骨髓有核细胞数量为（070.9）x1012,如果以骨髓细胞形态学的5%为阈值，那么AML患者获得CHR时，体内还剩余101。左右的白血病细胞；与CHR相比，MRD检测的敏感性为1O-2o-6（图1）。AML患者获得CHR并继续接受治疗后的转归如下：极少数患者发生早期复发；部分患者呈MRD持续阳性状态，最终发生晚期复发；部分患者由MRD阳性进入MRD阴性状态，即用现有的MFC、RQ-PCR和NGS等方法在患者体内检测不到白血病细胞；部分MRD阴性患者可再次转为MRD阳性导致晚期复发；部分患者获得临床治愈（图1）。现今，国内外学者尚不清楚AML患者经过诱导治疗、巩固治疗后体内的白血病负荷低于哪个“阈值”就可停止治疗，最终达到治愈的目标。IO12IOuo,010°IOsIO7IO6IO5IO4IO5IO2o,O初诊a诱导巩固（化疗/造血干细胞移植）维持AML:急性髓系白血病；MRD:微小残留病；detectableMRD:可检测到的MRD;undetectableMRD:不能检测到的MRDoa除初诊患者以外，难治/复发AML治疗后也需进行MRD评估图1AML患者治疗后MRD检测与疗效/预后模式图关于MRD有两个英文名词，即minimalresidualdisease（微小残留病）和measurableresidualdisease（可检测到的残留病）z前者和上面所述的概念一致；后者是指AML患者经过治疗后，无论获得CHR与否，体内可检测到的白血病细胞。迄今为止，在已经发表的国内外文献中，多数作者通过确定阈值将MRD分为阳性和阴性两种状态；然而，由于敏感性所限，文献中所描述的MRD阴性是指用现有方法检测不到患者体内存在白血病细胞，即MRD阴性可以是体内存在白血病细胞但检测不到，也可以是体内已不存在白血病细胞。因此，部分学者提出将MRD阳性和MRD阴性分别称为PeteCtableMRD（可检测到MRD）"和“UndeteCtabIeMRD（未检测到MRD）”（图1）o目前，临床常规应用和正在临床研究阶段的AMLMRD检测方法见表1。表1不同方法检测AML患者MRD的比较检测方法敏感性常规应用评价优点简便快捷、费用低，MFC1O-3io-5是适用90%以上的AML人群缺点：抗原漂移；不能确定特定白血病亚群翁析过程复杂RQ-PCR融合基因/NPM1突变10-410-6是优点：特异性好，敏感性高，相对便宜，易标准化缺点：耗时间、要求靶基因在疾病治疗过程中稳定表达、适用部分、RNA不稳定；仅适用30%60%的人群WT110-2是优点：适用80%90%的AML人群缺点：敏感性低、缺乏疾病特异性dd-PCR10-4-10-6否优点：绝对定量，不需要标准化曲线缺点:同RQ-PCR二代测序技术1O-3io-6否优点:可以同时检测多种突变位点,可观察克隆演变，高通量缺点：费用局I、结果易受背景噪音影响、无标准化注：AML:急性髓系白血病；MRD:微小残留病；MFC:多参数流式细胞术；RQ-PCR:实时定量聚合酶链反应；dd-PCR:数字聚合酶链反应()MFC检测MRD临床实践中，用于MFe评估表型异常白血病细胞的单克隆免疫荧光抗体包中舌CD34、CDll7、CD13和CD33,跨系表达抗原CD2、CD7、CD19和CD56等；需要注意的是，以CD7等标志进行MRD检测和分析时应考虑其在正常造血细胞上的表达情况。利用MFC检测MRD的方法包括白血病相关异常表型(LAIP)以及与正常骨髓细胞表型相鉴别(D-F-N,differentfromnormal)z前者是指初诊时确定患者的LAIP,在随后的治疗过程中利用LAIP进行MRD检测;后者可用于缺乏初诊LAIP的患者，也可检测治疗过程中出现的抗原漂移(Antigenshift)LAlP和D-F-N相结合既适用于缺乏初诊LAIP的患者，又可检测新出现的表型异常或LAIP发生的抗原漂移10,16124,25,26,27,28,29。本专家共识推荐：联合应用LAIP与D-F-N两种方法检测已知和(或)验证未知的、具有预后意义的白血病细胞表型异常。1 .检测技术要求：(1)流式细胞仪：诊断学组专家推荐应用至少八色荧光标记的MFC对标本进行MRD检测以提高特异性。不同实验室或同一实验室不同仪器应遵循标准化操作流程，参见多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识(2017年版)。(2)抗体组合和荧光标记：用于MRD检测抗体组合包括：骨干抗体有CD45、CDlI7、CD34、CD13以及CD33;其他抗体：例如借助CD4、CDllb、CDI4、CD64和HLA-DR等评估单核、粒-单核AML的MRD,利用CD7、CDI9、CD56等评估跨系抗原表达，应用CD133、CD38和CD123等检测白血病干/祖细胞。专家组推荐的八色MFC抗体组合如下：CD38-FITCCD33-PE-Cy5.5CD34-PE-Cy7CD13-APCHLA-DR-APC-H7(或APC-Cy7或APC-AlexaFlour750)/CD117-Bv421CD45-PacificOrangezPE通道可选择的抗体包括CD56xCDI9、CD2、CD4、CD5、CD7、CDlIb、CD64、CDl5、CD123xNG2(anti-7.1)、CDlO等；对于配备十色MFC的中心，可针对PE、Bv605ECD或APC-R700三个检测通道从可选择抗体中调配MRD检测十色抗体组合;各中心应根据AML亚型，可选择1管或多管抗体组合进行MRD检测。专家组建议运用典型LAIP与D-F-N方法检测所有异常表达(包括诊断时和治疗后新增的异常表达)，在诊断和随访中应用完整的抗体组合方案。(3)标本采集储存：MFC检测MRD所需标本可采用乙二胺四乙酸或肝素抗凝二者无显著区别。利用外周血(PB标本比骨髓BM)标本检测到的MRD低1个数量级,因此，专家组不推荐应用MFC检测PB标本中的MRDo为了确保MFC检测的敏感性，避免PB稀释BM标本z专家组建议使用抽取的第一管骨髓液（35ml）进行MRD评估，因为标本中PB含量随BM抽取量增加而增加，易导致BM有核细胞被稀释。如果BM标本中成熟中性粒细胞大于90%,则提示所采集的标本被PB稀释。针对不同的AML患者和治疗的不同时间点，骨髓穿刺操作者采集的BM标本体积应该保持一致。BM标本运输条件：临床常规检测和（或）多中心协作检测时,在室温条件下BM样本应于3d内完成抗体标记和检测。（4）样本抗体标记与检测：MRD检测前的标本准备工作包括：先行荧光抗体标记，再裂解红细胞，清洗过程中尽最大可能减少细胞丢失；先裂解红细胞，清洗后再行荧光抗体标记，优点是所有标记的流式管采用相同的操作流程。专家组推荐避光孵育条件下进行抗体标记。MFC检测MRD的方法参见多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微小残留病中国专家共识（2017年版）的“MRD检测质控和标准化”部分。2 .MRD的识别和评估：关于MFC检测的MRD识别和评估问题，专家组建议使用商用程序，同时确保仪器、设备、抗体组合等的标准化，本共识具体推荐如下：如初诊时LAIP明确则用LAIP测定MRD如初诊时LAIP不明确，则采用D-F-N方法确定新的LAIP注意患者之间LAlP的个体化差异。计算LAIP和（或）D-F-N方法检测的MRD细胞占CD45+细胞的比例。获取有核细胞数量50万100万（除外CD45-细胞和碎片），除在标本获取过程中看到明确的MRD细胞群以外，其他残留白血病细胞亚群需由技术熟练的操作者/具备流式细胞术专业知识的人员来确定。3 .MFC检测的MRD报告方式：MFC检测的MRD出具报告时应注意以下事项：LAIP细胞的免疫表型特征及其占BM或PB有核细胞的比例,有条件的单位可报告有核细胞和LAIP的绝对数量。对于初诊时的LAIP,应计算其占初诊白血病原始细胞的百分比。临床医师和实验室应协商是否需要确定MRD的阈值，如果没有利用MFC检测到确定的MRD细胞，应该在报告上写明MRD检测阴性。报告还应包括细胞活性、BM标本的增生程度、是否被PB稀释;如果可检测的细胞数量少，则在报告LAIP时给出检测到的总有核细胞数量。此外，欧洲白血病网（ELN）MRD工作组的共识推荐：如果MFC检测到的MRD<0.1%,应该在报告中写明”利用MFC可定量检测到MRD,但其临床意义不明”。然而，国内多数学者的研究表明MRD阳性（即MRD>O）和阴性（即MRD为0）二分类划分即可很好地预测预后。因此，本共识建议在报告中清晰描述MFC检测到的MRD水平即可。4 .MFC检测的MRD临床解读：（1）MRD阈值的确定：ELNMRD共识推荐MFC检测AML患者MRD的阈值为0.1%。然而，由于阈值受到治疗方法、检测时间点以及标本类型等多种因素的影响，MRD的最佳阈值确定尚存争议。本共识建议国内学者积极开展前瞻性、多中心研究确定不同治疗场景下MFC检测到的MRD阈值，以实现阈值个体化。（2）临床预后和指导治疗：诱导和巩固治疗后MFC检测MRD阳性提示复发率高、预后不良；对于无NPM1突变的成年AML患者，第2个疗程诱导治疗后MFC检测MRD阳性的患者可考虑选择allo-HSCT以改善预后。allo-HSCT前MFC检测到的MRD阳性也提示复发率高、预后不良；我国学者的研究结果提示对于移植前MFC检测MRD阳性的AML,单倍型相合移植的疗效优于HLA相合同胞供者移植。