锰过氧化物酶ManganeseperoxidaseMnp试剂盒说明书.docx

铳过氧化物酶（Manganeseperoxidase>Mnp）试剂盒说明书微法1OOT/96S注意:正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。测定意义：错过氧化物酶（EC1.U.1.13）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，主要存在于担子菌中，属于木质素降解酶系，能有效的降解木质素及废水和土壤中比较难降解的氯化物，叠氮化合物、DTT,多环芳煌等。测定原理：便过氧化物酶在Mn2存在的条件下，将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在465nm有特征吸收峰。自备实验用品及仪器：天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。试剂组成和配制：试剂一：液体IIOmLX1瓶，4C保存。试剂二：液体2mlX1支，4C保存。试剂三：液体5mlX1瓶，42避光保存。试剂四：液体2mll支，4C保存。醉液提取：1 .组织：按照质量（g）：试剂一体积（mL）为1：510的比例（建议称取约0.1g,加入ImL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4,IooOOg离心IOmin,取上清置于冰上待测。2 .细胞：按照细胞数量（IO"个）：试剂一体积（ml）为5001000:1的比例（建议500万细胞加入Iml试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4C,10000g离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .培养液或其它液体：直接检测。测定操作，1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至465nm,蒸储水调零。2、测定前将试剂一、二、三、四在37aC（哺乳动物）或25七（其它物种）放置Iomin以上。3、样本测定表试剂名称（L）测定管样本20试剂100试剂二20试剂三40试剂四20在微量石英比色皿或96孔板中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录465nm下30s时的吸光值Al和2min30s后的吸光值A2。计算A=A2-Alo注意I若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三、四按比例配成混合液，在37(哺乳动物)或25C(其它物种)放置IOmin以上，测定时加入20l样本和180l混合液测定。障活计算公式：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1 .按照蛋白浓度计算障活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化InmoI愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。MnP活性(nmol/min/mgprot)=AAxV反总÷(×d)×109÷(Vt×Cpr)÷T=413×A÷Cpr2 .按照样本质量计算障活性定义：每克样品每分钟氧化Inmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。MnP活性(nmol/min/g鲜重)=AAxV反总÷(×d)×109÷(V样W÷V样总)÷T=413×A÷W3 .按照细胞数量计算鲜活性定义：每IO4个细胞每分钟氧化InmOI愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。MnP活性(nmolmin104cell)=AAV反总÷(×d)×109÷(V样X细胞数量÷V样总)÷T=413A÷细胞数量4 .按照液体体积计算障活性定义：每亳升培养液每分钟氧化InmoI愈创木酚所需的酶量为一个所活力单位。MnP活性(nmol/min/mL)=AAxV反总中(×d)×109÷Vt÷T=413×A:愈创木酚摩尔消光系数：12100Lmolcm:d：比色皿光径，1cm：V反总：反应总体积，2l(lL;V样：反应中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g：T：反应时间，2minb.用96孔板测定的计算公式如下1 .按照蛋白浓度计算障活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化Inmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。MnP活性(nmol/min/mgprot)=AAxV反总÷(×d)×109)÷(Vt×Cpr)÷T=826×A÷Cpr2 .按照样本质量计算障活性定义：每克样品每分钟氧化Inmol愈创木酚所需的所量为一个所活力单位。MnP活性(nmol/min/g鲜重)=AAxV反总÷(×d)×109÷(V样W÷V样总)÷T=826×A÷W3 .按照细胞数量计算障活性定义：每IO4个细胞每分钟氧化InmOI愈创木酚所褥的酶量为一个酶活力单位。MnP活性(nmolmin104cell)=AAV反总÷(×d)×109÷(V样X细胞数量÷V样总)÷T=826A÷细胞数量4 .按照液体体积计算醉活性定义：每毫升培养液每分钟乳化Inmol愈创木酚所需的醉量为一个所活力单位。MnP活性(nmol/min/mL)=AAxV反总÷(×d)Xlo为印样村=826Ae：愈创木酚摩尔消光系数：12100Lmolcm:d：96孔板光径，0.5cm；V反总:反应总体积，2×104L；V样：反应中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g:T：反应时间，2min