第10章酶的作用机制和酶的调节.ppt

第第1010章章 酶的作用机制和酶的调节酶的作用机制和酶的调节活性中心（活性中心（active center)与酶活力直接相关的区域与酶活力直接相关的区域局限在酶分子的特定部位局限在酶分子的特定部位一、酶的活性部位一、酶的活性部位(active site）结合中心：与结合中心：与S结合结合 决定酶促反应的决定酶促反应的专一性专一性催化中心：促进催化中心：促进S发生化学变化发生化学变化 决定酶促反应的决定酶促反应的性质性质 活性中心活性中心与酶的催化活性直接相关的化学基团与酶的催化活性直接相关的化学基团常见：常见：His咪唑基、咪唑基、Ser-OH、Glu-COOH、Cys-SH、Asp-OH位于活性中心位于活性中心活性中心以外，活性中心以外，稳定分子构象稳定分子构象必需基团必需基团非必需基团非必需基团（一）必需基团（一）必需基团底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心（二）（二）酶活性部位的特点酶活性部位的特点1、几个残基几个残基+辅助因子（单纯辅助因子（单纯/结合）结合）2、在空间构象上集中到一起（单体在空间构象上集中到一起（单体/寡聚）寡聚）3、疏水空穴疏水空穴4、通过次级键与底物结合、通过次级键与底物结合6、活性中心构象具有柔韧性和可塑性、活性中心构象具有柔韧性和可塑性5、与底物诱导契合与底物诱导契合 酶酶 AA残基残基 活性中心活性中心AA 核糖核酸酶核糖核酸酶 124 H H K R D E溶菌酶溶菌酶 129 D E胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 241 H D S羧肽酶羧肽酶A 307 R E Y Zn2+胰蛋白酶胰蛋白酶 223 H D S 二、研究酶活性部位的方法二、研究酶活性部位的方法1.1.酶分子侧链基团的化学修饰法酶分子侧链基团的化学修饰法 化合物化合物活性部位活性部位AAAA残基侧链基团残基侧链基团 共价结合共价结合水解酶，确定一级结构位置水解酶，确定一级结构位置 推测某基团是否在活性中心推测某基团是否在活性中心 某基团被修饰后：某基团被修饰后：酶活力改变：为必需基团酶活力改变：为必需基团（1）非特异性共价修饰）非特异性共价修饰（2 2）特异性共价修饰）特异性共价修饰试剂专一修饰活性部位某试剂专一修饰活性部位某AAAA，使酶失活。，使酶失活。如：二异丙基氟磷酸（如：二异丙基氟磷酸（DFP)DFP)专一修饰专一修饰E Ser-OHE Ser-OHESer OH+(CH3)2CH OPOFO(CH3)2CHESer OPOOOCH(CH3)2CH(CH3)2酶DFPDIP-E仅修饰活性中心仅修饰活性中心Ser-OHSer-OH(3)(3)亲和标记法亲和标记法与与S S结构相似的共价修饰剂结构相似的共价修饰剂能被专一地引入活性部位，接近能被专一地引入活性部位，接近S S结合位点结合位点其活泼的化学基团可与活性部位某一基团其活泼的化学基团可与活性部位某一基团 形成稳定的共价键形成稳定的共价键CH2CH NHSO2CH3COOCH2CH3CH2CH NHSO2CH3COCH2ClRCOCH2Cl+NH32N1RCOCH2N32N1TPETPCKTPCKE-His57烷化失活His57-N3对甲苯磺酰对甲苯磺酰L苯苯丙氨酸乙酯丙氨酸乙酯 (TPE)对甲苯磺酰对甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮（苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶2.动力学参数测定法动力学参数测定法 活性部位活性部位AA残基解离状态和酶活性直接相关残基解离状态和酶活性直接相关 通过动力学方法求有关参数，通过动力学方法求有关参数，对酶活性部位化学性质作出判断。对酶活性部位化学性质作出判断。3.X射线晶体结构分析法射线晶体结构分析法 4.定点诱变法定点诱变法 利用定点诱变技术，改变编码蛋白基利用定点诱变技术，改变编码蛋白基因中的因中的DNA顺序，改变其中某顺序，改变其中某AA后，测定后，测定酶活性的变化。酶活性的变化。诱导契合机制诱导契合机制酶与底物靠近酶与底物靠近定向定向酶与底物相互诱导变形酶与底物相互诱导变形契合成中间产物契合成中间产物产物脱离产物脱离三、酶催化高效性的机制三、酶催化高效性的机制酶催化的本质：降低反应的活化能。酶催化的本质：降低反应的活化能。能能 量量 改改 变变活活 化化 过过 程程过渡态过渡态（一）底物和酶的（一）底物和酶的邻近效应和定向效应邻近效应和定向效应 静电吸引疏水作用底物底物酶酶（二）底物的形变和诱导契合（二）底物的形变和诱导契合互补性互补性结构变化结构变化能否契合能否契合专一性的由来专一性的由来 产物脱离产物脱离酶复原催化剂酶复原催化剂羧肽酶 A羧肽酶催化中的电子云形变 C=O靠近电子云形变 定向极性专一性契合区H2+NC精氨酸C端确认区注意酶活性中心提供酶活性中心提供/使敏感键断裂的机制。使敏感键断裂的机制。酸催化酸催化(OHOH、NHNH3 3+、NHNH+、-COOH-COOH、SH)SH)A A-:H H+EHEHE E-EH+OHEH+OH-+H+H+AH +BAH +B+碱催化碱催化(失电子态失电子态)A A-:B B+E-COO+E-COO-A A-+E-COOH+E-COOH E-COO E-COO-+H+H+（三）酸碱催化（三）酸碱催化碱碱催化催化酸酸催化催化稳定活性中心吸附羧氧原子使肽键失稳使肽键失稳 酶活性中心酶活性中心参与参与S敏感键断裂的机制。敏感键断裂的机制。亲电基团亲电基团带正电荷性质的基团带正电荷性质的基团亲核基团亲核基团带负电荷性质的基团带负电荷性质的基团（四）共价催化（四）共价催化A-:B+-OH -NH2 咪唑基咪唑基 亲电催化亲电催化2A-:2 B+Mg2+A:MgA+2B+亲核催化亲核催化-OH-SHA-:+HO:B 中间产物不稳定，断裂，形成产物，酶复原。中间产物不稳定，断裂，形成产物，酶复原。（不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。）（不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。）OH的亲核催化(胰凝乳蛋白酶)1 1、需要金属离子的酶、需要金属离子的酶（1 1）金属酶金属酶 (metalloenzyme)(metalloenzyme)含含紧密结合紧密结合的金属离子的金属离子（2 2）金属激活酶）金属激活酶(metal-activited(metal-activited enzyme)enzyme)含含松散结合松散结合的金属离子的金属离子（五）金属离子催化（五）金属离子催化2 2、金属离子的作用、金属离子的作用 A A、参与底物反应的定向、参与底物反应的定向 B B、通过价态改变参与电子转移、通过价态改变参与电子转移 C C、通过静电稳定、通过静电稳定/屏蔽负电荷屏蔽负电荷（六）多原催化和协同效应（六）多原催化和协同效应NHOOOH.CH3OCH3OCH3OCH3OOHCH3OCH3OCH3OCH3OCOHNOH.（七）活性部位微环境的影响（七）活性部位微环境的影响四、酶催化反应机制的实例四、酶催化反应机制的实例（一）溶菌酶（一）溶菌酶（lysozyme）（二）胰凝乳蛋白酶（二）胰凝乳蛋白酶疏水口袋疏水口袋活性位点残基活性位点残基4.丝氨酸蛋白酶的催化机制催化三联体催化三联体亲核攻击亲核攻击稳定稳定His的正电形式的正电形式胰蛋白酶胰蛋白酶蛋白质蛋白质水解酶水解酶巯基蛋白酶巯基蛋白酶天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶锌蛋白酶锌蛋白酶胰凝乳蛋质酶胰凝乳蛋质酶凝血酶凝血酶弹性蛋白酶弹性蛋白酶趋同进化（趋同进化（convergent evolution）：催化三联体）：催化三联体趋异进化（趋异进化（divergent evolution）：底物专一性）：底物专一性（三）烯醇化酶（三）烯醇化酶（enolase）作用需要金属离子作用需要金属离子碱催化碱催化稳定中间产物稳定中间产物酸催化酸催化（allosteric regulation）：酶分子的非催化部位与某些化酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态。变，进而改变酶活性状态。：具有别构现象的酶。具有别构现象的酶。：能使酶分子发生别构作用的物质。能使酶分子发生别构作用的物质。别构激活剂别构激活剂别构抑制剂别构抑制剂2、别构酶的特点别构酶的特点ONH2CO-O-OOP+Pi+-OOCCH2ONH2C NHCCOO-NH3+COO-CH2CCOO-HONHNHOCOO-OO-OOPO-OOPO-O-OPNH2NNOOH-OHH2COCTP（嘧啶生物合成的终端产物)CTP反馈抑制ATCaseZn2+ATCaseATP 别构激活剂别构激活剂CTP 别构抑制剂别构抑制剂天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰酶调节亚基调节亚基催化亚基催化亚基 3磷酸甘油醛脱氢酶磷酸甘油醛脱氢酶 具有负协同效应的别构酶代表具有负协同效应的别构酶代表 S形曲线（正协同）形曲线（正协同）表观双曲线（负协同效应）表观双曲线（负协同效应）（2）别构酶的动力学）别构酶的动力学V=V VSKm+S当V=90V0.9Km=0.1SS9Km当V=10VS1/9Km10%V 时s90%V时 s=81协同协同81V随随S而而2 2米氏曲线米氏曲线1 1负协同负协同3 3正协同正协同S90%VS10%V81321V1 0%V V90%V V0 SVa、仅底物是别构调节物、仅底物是别构调节物协同协同81V随随S而而底物是别构抑制剂底物是别构抑制剂底物是别构激活剂底物是别构激活剂b、当其他别构物参与调节时、当其他别构物参与调节时 整体上产生激活、抑制现象整体上产生激活、抑制现象 改变了调节的敏感区位置改变了调节的敏感区位置别构激活别构激活别构抑制别构抑制V0 S底物敏感区底物敏感区（3 3）K型效应物和型效应物和V型效应物：型效应物：K0.5：别构酶催化反应达到别构酶催化反应达到1/2 Vmax时的时的S改变改变K0.5不改变不改变Vmax：K型效应物型效应物改变改变Vmax不改变不改变K0.5：V型效应物型效应物213213vvVmaxVmaxK0.500SSA A为为K K型效应物型效应物 B B为为V V型效应物型效应物1.1.未加效应物；未加效应物；2.2.加激活剂；加激活剂；3 3加抑制剂加抑制剂A A为为K K型效应物型效应物B B为为V V型效应物型效应物别构酶经加热或用化学试剂等处理，可别构酶经加热或用化学试剂等处理，可引起别构酶解离，失去调节活性。引起别构酶解离，失去调节活性。脱敏后表现为米氏酶动力学双曲线脱敏后表现为米氏酶动力学双曲线（4）脱敏作用）脱敏作用3 3、别构酶调节酶活性的机理、别构酶调节酶活性的机理 1、对称或协同模型（、对称或协同模型（symmetry or concerted model,也称齐变模型、也称齐变模型、MWC模型）模型）1965年由年由Monod、Wyman和和Changeux提出。提出。该模型的要点该模型的要点:2、序变模型（、序变模型（sequential model，也称，也称KNF模型）模型）1966年由年由Koshland、Nemethy和和Filmer提出。提出。该模型的要点该模型的要点:（二）酶原的激活（二）酶原的激活J 酶原酶原：酶的无活性的前体：酶的无活性的前体J 酶原的激活酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。性的酶的过程。J 酶原激活的意义酶原激活的意义：在特定的环境和条件下：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以视为酶的储存形式。以视为酶的储存形式。G 酶原激活的机理酶原激活的机理:酶酶 原原分子构象发生改变分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽掉一个或几个短肽在特定条件下在特定条件下赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天