第10章抗原抗体反应.ppt

第十章 抗原抗体反应 免疫测定 Immunoassay,IA 一、抗原抗体反应的特点 （体外反应）p176 特异性 交叉性 两种抗原含有共同部分（同抗原决定基）比例相关性/按比性 可逆性 如提取纯化，亲和层析 阶段性 第一阶段 AgAb特异结合，几分钟 第二阶段 出现肉眼可见变化：凝集、沉淀、溶解、标记放大。几分钟、几小时二、影响AgAb 反应的因素 电解质 0.85NaCl 或其他 Buffer 酸碱度 pH68 温度 最适 37，低温缓慢，室温也可，不高于56三、AgAb反应（试验）种类 凝集反应 agglutination test 概念：颗粒Ag 与相应Ab 结合，在电解质存在下，经过一定时间（几分几小时）出现肉眼可见的凝集块现象称为凝集反应 凝集原 凝集素 凝集试验的类型 直接凝集反应 试管凝集试验 玻片凝集试验 如血型检验、O抗原检验 间接凝集试验 将可溶性Ag，或者把Ab 吸附于不直接参与和干扰AgAb反应的颗粒载体上，然后使二者混合发生凝集反应。协同凝集反应 属于间接凝集反应 间接凝集反应 沉淀反应 概念 指可溶性Ag 与相应Ab 特异结合，形成免疫复合物在电解质影响下形成沉淀现象。沉淀原 precipitinogen 可溶Ag 如 细菌浸出液 沉淀素 precipitin 沉淀试验类型 环状沉淀试验 液体中直接沉淀 凝胶沉淀试验/免疫扩散 双向免疫扩散 免疫单扩散 免疫电泳 补体结合反应/试验 AgAb 特异结合后，补体参与下，发生溶菌、溶细胞、溶血现象。溶血素 标记抗原抗体反应/技术 免疫标记技术 概念 指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金、生物素亲和素等标记Ab 或 Ab，后进行的AbAg 反应。一抗、二抗（抗抗体）、酶标二抗 荧光素、放射性同位素、酶标记最为成熟，称为免疫学三大标记技术 免疫标记技术的优点 a 特异性强 b 敏感性高 c 快速 d 能定性、定量和定位ELISA 测定原理ELISA，enzyme-linked immunoadsorbent assay 酶联免疫吸附试验 一种标记 抗体/抗原 的 分析技术ELISA 种类 夹心法 间接法 竞争法 双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。双抗原夹心法（抗-HBs等）示意图1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体-酶标记抗原复合物。4.酶催化底物并显色。酶抗原酶标记 抗原抗体抗原固相载体酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。间接法（抗-HCV等）示意图捕捉法（抗-HAV IgM、抗-HDV IgM等）示意图酶抗体酶标记 抗体抗原抗抗体固相载体抗体1.将抗抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物。3.加入抗原及酶标记抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。免疫胶体金技术简介 胶体金作为示踪标志物标记抗原（半抗原）或抗体 目前发展为一种常用的标记技术 各种生物学研究中广泛使用。各种食品卫生、安全指标的最快速检测几乎都用免疫胶体金技术。医学诊断使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能用到。免疫胶体金技术的基本原理：还原剂 弱碱性 蛋白质阳离子基团 氯金酸 金颗粒 阴离子胶体 胶体金蛋白质HAuCl4 胶体金标记物：抗原、半抗原、抗体均可标记 多种生物大分子，如SPA、PHA、ConA等。免疫金标记技术 Immunogold labelling technique 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。常用的免疫胶体金检测技术：免疫胶体金光镜染色法 细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色。免疫胶体金电镜染色法 斑点免疫金渗滤法 应用微孔滤膜（硝酸纤维膜）作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。胶体金免疫层析法 immunochromatography 免疫层析胶体金测试片 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。