抗体制备课件.ppt

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 图图4 亲和层析纯化亲和层析纯化IgG基本过程示意图基本过程示意图 31 32 33 34 35 是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体。其理化性状高度均一、效价高、只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一，具有高度特异性又易于大量制备36 37 38 39 40 41 42 1.主要材料主要材料2.细胞融合前准备细胞融合前准备3.细胞融合细胞融合 4.抗体的初筛和克隆化抗体的初筛和克隆化5.杂交瘤细胞冻存与复苏杂交瘤细胞冻存与复苏6.单克隆抗体的批量生产单克隆抗体的批量生产7.单克隆抗体的纯化与鉴定单克隆抗体的纯化与鉴定43 44 45 46 47 48 49 初次免疫初次免疫 Ag150g加福氏完全佐剂皮下多点注射加福氏完全佐剂皮下多点注射 (一般一般0.81ml0.2ml点点)3周后周后 第二次免疫第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(ip剂量不宜超过剂量不宜超过0.5ml)3周后周后第三次免疫第三次免疫剂量同上，不加佐剂，剂量同上，不加佐剂，ip (57天后采血测其效价，检测免疫效果天后采血测其效价，检测免疫效果)23周后周后 加强免疫加强免疫，剂量，剂量50500g为宜，为宜，ip或或iv3天后天后取脾融合取脾融合50 初次免疫 1100.5ml ip(腹腔内注射)23周后第二次免疫 1100.5ml ip3周后加强免疫(融合前三天)1100.5ml ip或iv(静脉内注射)取脾融合51 小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠腹腔巨噬细胞的制备 常用常用BaLbc小鼠小鼠610周龄周龄 拉颈处死浸泡于拉颈处死浸泡于75酒精，消毒酒精，消毒35分钟分钟 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 用无菌注射器注入用无菌注射器注入68ml培养液培养液 反复冲洗，吸出冲洗液反复冲洗，吸出冲洗液 放入放入10ml离心管，离心管，1200转分离心转分离心56分钟分钟 用用20小牛血清小牛血清(NCS)或胎牛血清或胎牛血清(FCS)的培养液混悬的培养液混悬，调整细胞数调整细胞数110ml 加入加入96孔板，孔板，100l孔孔 放入放入37CO2孵箱培养孵箱培养52 53 54 55 脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数为为10左右。左右。56 1.细胞融合细胞融合 2.HAT 2.HAT选择杂交瘤选择杂交瘤(二二)细胞融合，选择杂交瘤细胞融合，选择杂交瘤57 以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原用于可溶性抗原(蛋白质蛋白质)、细胞和、细胞和病毒等病毒等McAb的检测。的检测。2.RIA用于可溶性抗原、细胞用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。的检测。3.FACS(荧光激活细胞分类仪荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞用于检查细胞表面抗原的表面抗原的McAb检测。检测。58 59 60 61 62 63 64 基因工程抗体基因工程抗体(重组抗体重组抗体)65 66 67 68 69 70 抗原结合片段（Fab）可变区片段（Fv）单链抗体（single chain Fv，ScFv）71 72 73 74 75 抗体融合蛋白是指将抗体分子片段与其他蛋白融合所得到的产物 76 77 78 79