氨基酸自动分析仪.ppt

XO3-Na+H3N+CHRCOOHXSO3-H3N+CHRCOOH +Na+PH减小PH增大PH小于氨基酸的等电点时，氨基酸带正电荷，可被磺酸基团吸引，随着PH升高或离子强度增大，氨基酸所带正电荷减少，吸引力下降乃至消失而被洗脱下来。衍生方式：衍生方式：1、柱前衍生法：、柱前衍生法：将将AA混合物先衍生后，在用反相混合物先衍生后，在用反相 分配分配色谱法分离，测定其紫外吸收或产生的色谱法分离，测定其紫外吸收或产生的荧光强度。荧光强度。2、柱后衍生法：、柱后衍生法：将将AA混合物用离子交换色谱法分离，在混合物用离子交换色谱法分离，在把分离后的氨基酸衍生为具有可见吸收把分离后的氨基酸衍生为具有可见吸收或产生荧光的物质，然后测定。或产生荧光的物质，然后测定。（1）茚三酮法）茚三酮法多数氨基酸与水合茚三酮在弱酸条件下共多数氨基酸与水合茚三酮在弱酸条件下共热，引起热，引起AA的氧化脱氨、脱羧反应，水的氧化脱氨、脱羧反应，水合茚三酮与氨合还原茚三酮反应，生成紫合茚三酮与氨合还原茚三酮反应，生成紫色色DYDA，最大吸收，最大吸收570nm（脯氨酸与羟（脯氨酸与羟脯氨酸例外，生成黄色化合物，最大吸收脯氨酸例外，生成黄色化合物，最大吸收440nm）。）。最后根据吸光度与峰面积的关系定性定量最后根据吸光度与峰面积的关系定性定量分析。分析。洗脱装置色谱柱（控温）混合室反应器检测器工作站衍生液（1）输液系统）输液系统组成：组成：泵、切换阀或梯度洗脱装置；泵、切换阀或梯度洗脱装置；作用：作用：输送缓冲液、衍生试剂、输送缓冲液、衍生试剂、再生液；再生液；要求：要求：流量恒定、流速稳定、较高的输出流量恒定、流速稳定、较高的输出压、输出流量范围大。压、输出流量范围大。（2）进样分离系统）进样分离系统组成：进样器、色谱柱组成：进样器、色谱柱AA最佳分离温度：最佳分离温度：3070度，度，需恒温，一般柱温升高，出峰时需恒温，一般柱温升高，出峰时间缩短。间缩短。（3）检测系统）检测系统取决于取决于AA衍生的方式衍生的方式:茚三酮法，柱后衍生。茚三酮与分离后的茚三酮法，柱后衍生。茚三酮与分离后的AA混合并在混合并在100左右的水浴中反应左右的水浴中反应15min，最后由紫外检测仪检测。最后由紫外检测仪检测。OPA法，分离柱流出液与法，分离柱流出液与NaClO混合，再混合，再与与OPA混合，生成荧光衍生物，采用荧光混合，生成荧光衍生物，采用荧光光度计分析测定。光度计分析测定。常见的仪器的主要性能：见表38-4（p183）试液澄清透明无可见杂质，放置或离心不产生试液澄清透明无可见杂质，放置或离心不产生沉淀；沉淀；试液无色或略带浅黄色，否则需脱色处理（活试液无色或略带浅黄色，否则需脱色处理（活性炭对芳香族性炭对芳香族AA有吸附，导致检测结果偏有吸附，导致检测结果偏低）；低）；含盐量要低；含盐量要低；无蛋白质或肽类物质（水解充分）；无蛋白质或肽类物质（水解充分）；以以PH2。2为宜；为宜；AA浓度以浓度以0。144mg/mL（110ng/50ul）为）为宜。宜。（1）酸水解）酸水解盐酸水解法盐酸水解法 被破坏的：被破坏的：Met、Trp；不易水解：不易水解：Ile、Leu、Val。过甲酸氧化法过甲酸氧化法（3）血清与生理体液样品的处理）血清与生理体液样品的处理方法方法血清样品：加入磺基水杨酸钠，混匀，血清样品：加入磺基水杨酸钠，混匀，超高速离心，取上清夜。超高速离心，取上清夜。生理体液样品：除去蛋白质、脱盐、脱生理体液样品：除去蛋白质、脱盐、脱色。色。