高原低压低氧环境对小鼠海马组织损伤及自噬的影响.docx

高原低压低氧环境对小鼠海马组织损伤及自噬的影响杨柯I郭晓宇2,赵霄晨I,吴涛1,潘耀柱I白海I,牛廷献3中国人民解放军联勤保障部队第940医院，I血液科，2检脸科，3基础医学科,甘肃兰州730050【摘要】目的研究高原低压低氧环境对小鼠海马组织损伤及自噬的作用。方法BALbZc小鼠随机分为实验组(低压氧舱模拟8000m海拔)和常氧对照组(舱外常规饲养)，24h及48h后采用高架十字迷宫评估小鼠焦虑情绪变化，组织染色观察海马神经元细胞病理学变化，透射电镜观察小鼠海马组织神经元细胞自噬溶醐体数量，WesternBlot法检测低氧诱导因子-Ia(HlF-Ia)及自噬相关蛋白BeClin-I和LC3B的表达水平变化。结果与常氧对照组相比，高原低压低氧环境明显增加了小鼠的焦虑情绪并使神经元细胞受到了病理学损伤；神经元细胞自噬溶防体数量、HIF-Ia>BeCIin-I及LC3B的表达较常氧对照组也均明显增加，差异具有统计学意义(pV005)<,结论高原低压低氧是造成小鼠产生焦虑情绪和海马组织病理学损伤的重要因素，可诱导神经元细胞HIF-Ia及自噬水平增加，且神经元细胞损伤程度与自噬水平呈正相关。【关键词高原：低压低氧；海马组织；自噬【中图分类号】R446;R557【文献标识码】A【文章编号】Effectsofhighaltitude,lowpressureandhypoxiaonhippocampaltissueinjuryandautophagyinKe1,GUOXiao-yr,WUTao1,PANYao-zhu1,BAIHai,NIU940thHospitaloftheJointLogisticSupportForceofthePeople'sLiberationAnny,1hematologydepatmeU,2laboratorydepartments/basicmedicaldepartments,Lanzhou730050,gansuAbstractObjectiveTostudytheeffectsoflow-pressureandlow-oxygenenvironmentonhippocampaltissuedamageandautophagyindsBALb/cmicewererandomlydividedinto基金项目：国家自然科学基金()；全军后勤科研项目(CLBI9J047)；甘肃省卫生行业科研计划(GSWSKY-2019-63)：甘肃省自然科学基金(20JR5RA602)：甘肃省青年科技计划(17JR5RA326)；全军实验动物专项(SYDW)通讯作者：吴涛,E-mail:experimentalgroup(lowpressureoxygenchambersimulated8000maltitude)andnormoxiacontrolgroup(extravehicularconventionalbreeding),Theanxietyofmicewasassessedbyelevatedcrossmazeafterexposureto24hand48h,Histologicalobservationofhippocampalneurons,Thenumberofautophagylysosomesinmousehippocampalneuronswasobservedbytransmissionelectronmicroscopy,Theexpressionlevelsofhypoxiainduciblefactor-Ia(HIF-Ia)andautophagyrelatedproteinBeclin-IandLC3BweredetectedbyWesternBlottsComparedwithnormoxiacontrolgroup,lowpressureandlowoxygenenvironmentsignificantlyincreasedtheanxietyofmiceandcausedpathologicaldamagetoredwithnormoxiacontrolgroup,thenumberofautophagylysosomeandtheexpressionofHIF-I,Beclin-IandLC3Binneuronswerealsosignificantlyincreased,withstatisticalsignificance(P<0.05).ConclusionHighaltitudehypoxiaisanimportantfactorcausinganxietyandhiptopathologicaldamageinmice.ItcaninducetheincreaseofHIF-Iaandautophagyinneurons,andthedegreeofneuronaldamageispositivelycorrelatedwiththelevelofautophagy.KeywordsHighaltitude:hypobarichypoxia;hippocampalformation;autophagy高海拔边境作战和执行多样化军事任务是目前重要的国防战略，急进高原部队极易被诱发多器官损伤，且发病急、症状重，尤其造成严重且不可逆的脑缺氧损伤UL因此，深入进行高原病的防治研究，对于有效降低急性高原病发病率、保障高原地区军民健康、促进青藏高原等地区经济建设和西北边防巩固具有重要意义。研究表明，缺氧会诱发线粒体自噬，增强自噬基础水平能有效提高青藏高原居民的耐缺氧能力，有效改善神经元在高原缺氧应激下的损伤，起保护作用。本研究通过模拟高原低压低氧环境，研究小鼠海马组织损伤及对神经元自噬水平的影响，为下一步深入研究自噬与高原低压低氧性脑损伤的相互关系及分子机制奠定基础。1材料与方法1.1 实验动物及分组SPF级雄性BALb/c小鼠体质量2530g,由联勤保障部队第九四。医院实验动物中心提供。小鼠随机分为常氧对照组、低压低氧处理24h及48h组，每组10只，此实验经过中国人民解放军联勤保障部队第九四O医院动物医学研究伦理委员会批准。1.2 实验动物模型及取材本研究实验组采用低压氧舱(贵州风雷，DYC-3070)模拟800Om海拔建立实验条件。舱内温度2325°C左右，舱内湿度4045%左右，运行时间为24hd,昼夜比为l:lo实验期间小鼠自由摄食及饮水。对照组设于舱外常规(兰州海拔150Om)饲养。实验组低压氧舱饲养24h及48h后处死，处死前水合氯醛(ImI/100g小鼠体重)腹腔注射以及麻醉断头，切开小鼠头部皮肤，以矢状缝为纵轴线剪开颅顶骨及硬脑膜，去除颅骨并剥离软脑膜，弯镒对大脑皮层进行剥离后使用眼科镜小心取出海马组织，立即移入预冷的冻存管中，放入-80C低温冰箱中保存。1.3 高架十字迷宫实验实验开始时将小鼠从中央格面向闭合臂放入迷宫，记录5min内的活动情况，计算开放臂停留时间比例(OATlME,%)和开放臂进入次数tkJ(OAEntries,%),实验完成后将小鼠取出，将运动臂及闭合臂清理干净，酒精去除气味，最后用动物行为学软件进行数据分析。1.4 海马组织染色将海马组织用4%甲醛固定后，石蜡包埋、切片，脱蜡后HE染色，光学显微镜下观察神经元细胞形态。1.5 电镜检测自噬溶酶体将海马组织修剪成约2m?大小，4%戊二醛浸泡固定、PBS液冲洗后，1%钺酸浸泡后固定，待组织块完全氧化变黑后再用PBS液冲洗，常规丙酮脱水后环氧树脂混合物包埋制成电镜标本。用超薄切片机进行切片，厚度为60nm,醋酸铀和柠檬酸铅电子染色后，透射电子显微镜观察、照相。1.6 Westernblot检测蛋白表达水平将冰上分离的海马组织添加细胞裂解液后匀浆，充分裂解后，将裂解物4下12000rpm离心5min,BCA法测定上清液的蛋白质浓度，蛋白上样量为50g,聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜，在5%脱脂牛奶中封闭2h,与兔抗鼠HlF-Ia、兔抗鼠beclin-1、兔抗鼠LC3和兔抗鼠p-actin(l:IO(X)稀释；ABclonal)4C共孵育过夜，然后与山羊抗兔IgG(1:5O(M)稀释；中衫金桥)在室温下孵育Ih,电化学发光后采集图像。1.7 统计分析应用SPSS23.0软件，多组平均值比较采用单因素方差分析(OnewayANOVA),组间数据两两比较采用t检验，尸V0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1 高原低压低氧环境对小鼠焦虑情绪的影响与常氧对照组相比，低压低氧处理组开臂滞留时间比例（图IA）及开臂进入次数比例（图IB）均明显减低，其中24h组下降程度最明显，差异均有统计学意义（PV0.05）。对照组24h处理组48h处理组图1高原低氧环境对小鼠焦虑情绪的影响注：图A,横坐标为暴露时间，纵坐标为开臂滞留时间比；图B,横坐标为暴露时间，纵坐标为开臂进入次数比。与对照组相比，*PV0.05°2.2 高原低压低氧环境对海马神经元的组织形态学影响常氧对照组小鼠海马神经元细胞大部分呈圆形或椭圆形，排列紧密，细胞质染色均匀，无明显形态学病理改变。低压低氧处理组中，海马CAl区细胞结构不清，形态不规则，其中24h组损伤最严重，可见大部分细胞开始变形，胞核固缩及碎裂溶解，胞浆深染,胞核和胞质边界不清，48h组比24h组损伤稍轻（见图2）0图2高原低氧环境对小鼠海马组织形态改变的影响(HE染色)24h处理组48h处理组2.3 高原低压低氧环境对小鼠海马自噬溶酶体的影响通过透射电镜观察发现，与常氧对照组相比，低压低氧处理组神经元细胞内自噬溶酶体数量明显增多，其中24h组自噬溶酶体数量最多，细胞结构有部分破坏，48h组细胞内仍可见大量自噬溶酶体。图3透射电镜观察自噬小体(15000)2.4 高原低压低氧环境对小鼠海马组织HIF-Ia表达水平的影响通过WeStemblot检测HIF-Ia蛋白水平变化，与常氧对照组相比，低压低氧处理24h和48h组均明显增加，差异有统计学意义(PVo.05),且随着暴露时间延长而逐渐增加，见图4oco*.E对照组 24h处理蛆48h处理组对照组24h处理组48h处理组图4高原低压低氧环境对小鼠海马组织HIF-Ia及自噬相关蛋白LC3B和bedin-1表达的影响(注：与对照组相比，*PV0.05)2.5 高原低压低氧环境对小鼠海马组织自噬相关蛋白BeClin-I和LC3B表达水平的影响与常氧对照组比较，低压低氧处理组BeCIin-I和LC3B的表达水平明显升高，其中24h处理组表达水平升高程度最明显，差异有统计学意义(PV0.05),如图4所示。3讨论目前，对高原引起脑损伤的大部分研究主要采用单纯模拟低氧的方法，认为缺氧是造成急进高原脑细胞损伤的主要原因，而忽略了气压的作用。研究发现，海马CAl区是海马所有区域内最易受缺氧损伤的部位，严重影响认知功能网。本研究通过对海马CAI区组织染色发现，急性高原低压低氧处理24h和48h后均明显造成了小鼠海马神经元细胞的病理损伤，这可能也是导致小鼠出现焦虑情绪的重要原因。低氧诱导因子(HyPOXiainduciblefactor,HIF)的主要功能是平衡体内氧含量，其主要由和两个亚基构成，HIF-Ia被认作为氧平衡的主要调节转录因子，缺氧环境下，HIF-Ia亚基的大量积累可以启动多种低氧反应基因的转录，诱导靶基因的表达，从而相应地启动广泛的适应以维持氧的传递。本研究结果发现，不同时长的高原低压低氧处理比平原对照组均能诱导表达更多的HIF-Ia,随着暴露时间的延长，表达逐渐升高，这可能与大脑强烈需要适应低氧环境应激反应有关。此外，在低氧环境下，HIF-I可调节B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)与BNlP