茚三酮显色法测定氨基酸含量.ppt

实验三实验三茚三酮显色法测定氨基酸含量茚三酮显色法测定氨基酸含量一、实验原理一、实验原理 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，合物。颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定可通过测定570nm570nm处的光密度，测定氨基处的光密度，测定氨基酸的含量酸的含量二、试剂与材料二、试剂与材料v（1 1）标准氨基酸溶液：标准氨基酸溶液：配制成配制成0.3mM0.3mM溶液溶液（本实验用赖氨酸）（本实验用赖氨酸）(已配已配)v（2 2）pH5.4,pH5.4,2M2M醋酸缓冲液：醋酸缓冲液：量取量取2M 86ml2M 86ml醋酸钠溶液，加入醋酸钠溶液，加入14ml 2M14ml 2M乙酸混合而成。乙酸混合而成。用用pHpH计较正（计较正（250ml/250ml/班）班）v（3 3）茚三酮显色液：茚三酮显色液：称取称取85mg85mg茚三酮和茚三酮和15mg15mg还原茚三酮，用还原茚三酮，用10ml10ml乙二醇甲醚溶解乙二醇甲醚溶解（15ml/15ml/组）组）v还原型茚三酮按下法制备：称取还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g0.5g茚三酮茚三酮，用用12.5ml12.5ml沸蒸馏水沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将溶解，得黄色溶液。将0.5g0.5g维生素维生素C C用用25ml25ml温蒸馏水温蒸馏水溶解，一边搅溶解，一边搅拌一边将维生素拌一边将维生素C C溶液滴加到茚三酮溶液中，溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀滴定后继续不断出现沉淀滴定后继续搅拌搅拌15min15min，然后，然后在冰箱内冷却到在冰箱内冷却到44，过滤、沉淀用冷水洗，过滤、沉淀用冷水洗涤涤3 3次，次，真空干燥，真空干燥，置五氧化二磷真空干燥置五氧化二磷真空干燥器中保存备用器中保存备用（4 4）60%60%乙醇（乙醇（50ml/50ml/组组 ）（5 5）样品液：每）样品液：每mlml含含0.5-50ug0.5-50ug氨基酸（已配）氨基酸（已配）（6 6）分光光度计）分光光度计（7 7）水浴锅）水浴锅1 1、标准曲线的制作、标准曲线的制作 分别取分别取0 0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml0.3mM0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml0.3mM的的标准氨基酸标准氨基酸溶液于试管中，用水溶液于试管中，用水补足到补足到1ml1ml。各加。各加入入1ml2M1ml2M醋酸缓冲液醋酸缓冲液；再加入；再加入1ml1ml茚三酮茚三酮显色液，充显色液，充分混合后盖住试管口，在分混合后盖住试管口，在100100水浴中加热水浴中加热15min15min，用自来水冷却。放置用自来水冷却。放置5min5min后，加入后，加入3ml60%3ml60%乙醇乙醇稀释，稀释，充分摇匀，用分光光度计测定充分摇匀，用分光光度计测定ODOD570570（脯氨酸和羟脯（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定ODOD440440）。以）。以ODOD570570为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。三、操作方法三、操作方法2 2、氨酸酸样品的测定：、氨酸酸样品的测定：取取样品液样品液1ml1ml，加入，加入pH5.4,pH5.4,2M2M醋酸缓冲液醋酸缓冲液和和茚三酮茚三酮显色液显色液各各1ml1ml混匀后于混匀后于100100沸水中加热沸水中加热15min15min，自自来水冷却。放置来水冷却。放置5min5min后，加后，加3ml60%3ml60%乙醇乙醇稀释，摇稀释，摇匀后测定匀后测定ODOD570570（生成的颜色在（生成的颜色在60min60min内稳定）内稳定）将样品测定的将样品测定的ODOD570570与标准曲线对照，可确定样品与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸的含量中氨基酸的含量 样品同时做三份取平均数样品同时做三份取平均数四、结果与计算四、结果与计算 氨基酸的含量氨基酸的含量(g/100ml)=X(g/100ml)=X*100100X X为查标准曲线所获得每为查标准曲线所获得每mlml含量含量g g数数 自配样品自配样品X X*250/250/称取克数（称取克数（X X为查标准曲线所获得为查标准曲线所获得每每mlml含量含量g g数）数）250250为稀释的倍数为稀释的倍数 五、讨论与分析五、讨论与分析 六、思考题六、思考题 茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定？