质粒提取定量与酶切鉴定.ppt

质粒质粒DNA的提取、定量的提取、定量与酶切鉴定与酶切鉴定实验流程图实验流程图一、碱裂解法提取质粒一、碱裂解法提取质粒三、质粒酶切三、质粒酶切二、质粒定量二、质粒定量四、酶切产物的琼脂糖电泳检测四、酶切产物的琼脂糖电泳检测最后做最后做 掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握碱裂解法提取质粒的方法 掌握紫外吸收测定掌握紫外吸收测定DNADNA的方法的方法 了解质粒酶切鉴定原理了解质粒酶切鉴定原理 掌握琼脂糖凝胶电泳技术掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验目的实验目的实验材料实验材料大肠杆菌大肠杆菌DH5a菌株菌株pMD18-T载体载体易瑞质粒小量提取试剂盒易瑞质粒小量提取试剂盒Takara EcoRI 限制性内切酶限制性内切酶Takara Hind III 限制性内切酶限制性内切酶Takara 10 M 酶切缓冲液酶切缓冲液BioWest电泳琼脂糖干粉电泳琼脂糖干粉0.5TBE核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液EB 核酸荧光染料核酸荧光染料Takara 6 电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液实验仪器实验仪器 微量移液器微量移液器 离心机离心机 恒温水浴箱恒温水浴箱 紫外检测仪紫外检测仪 电泳仪电泳仪 水平电泳槽水平电泳槽 独立于细菌染色体独立于细菌染色体以外，能独立自主以外，能独立自主复制的闭合环状复制的闭合环状DNA分子分子 基因工程常采用的基因工程常采用的载体载体一、碱裂解法提取质粒一、碱裂解法提取质粒DNA 碱裂解法碱裂解法；煮沸裂解；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法；羟基磷灰石柱层析法；质粒质粒DNA释放法；释放法；酸酚法等酸酚法等质粒提取方法：质粒提取方法：碱裂解法碱裂解法基本原理基本原理 基于染色体基于染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的的变性与复性的 差异而达到分离目的。差异而达到分离目的。染色体染色体DNA：氢键断裂，：氢键断裂，变变性性。质粒质粒DNA：大部分氢键断裂，：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。条互补链不会完全分离。（不完全变性）（不完全变性）质粒质粒DNA：复性复性，溶于溶液中，溶于溶液中染色体染色体DNA：不能复性不能复性；形成缠连；形成缠连的网状结构。的网状结构。pH=12.6（碱性）（碱性）NaAc溶液溶液（pH4.8）pH=中性中性染色体染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来复合物等一起沉淀下来离心离心pMD18-Tu溶液溶液S1（细菌悬浮液）（细菌悬浮液）u裂解液裂解液S2u中和液中和液S3u洗涤液洗涤液Wu洗脱液洗脱液uRNase A(100mg/ml)uDNA吸附柱吸附柱试剂盒的组成：试剂盒的组成：溶液溶液S1：50 mmol/L葡萄糖葡萄糖10 mmol/LEDTA25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克毫克/毫升溶菌酶毫升溶菌酶裂解液裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1%SDS中和液中和液S3：3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液溶液1,取取1.5ml培养物加入培养物加入Eppendorf管中，室温离心管中，室温离心12000rpm1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。2,加入加入250l 溶液溶液S1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。3,加入加入250l 裂解液裂解液S2，颠倒，颠倒46次混匀（次混匀（不要剧烈振荡不要剧烈振荡），室温静），室温静置置3min（不超过（不超过5min）。）。4,加入加入350l 中和液中和液S3，立即温和颠倒，立即温和颠倒68次混匀，至出现白色絮状沉次混匀，至出现白色絮状沉淀。淀。5，室温，室温12000rpm离心离心10min。6,分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次600l，室温，室温12000rpm离心离心30s，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。7,向吸附柱中加入向吸附柱中加入600l 洗涤液洗涤液W，12000rpm离心离心30s，弃滤液。，弃滤液。8,重复步骤重复步骤7一次。一次。9,空柱空柱10000rpm离心离心2min。10,取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50l 56 预热的洗脱液，室温放置预热的洗脱液，室温放置1min，12000rpm离心离心1min，收集洗脱，收集洗脱液（即纯化的质粒液（即纯化的质粒DNA），），-20保存备用。保存备用。实验流程实验流程1.5mL 菌液菌液12000rpm1 min菌体沉淀菌体沉淀溶液溶液S1250l剧烈震荡剧烈震荡裂解液裂解液S2250l颠倒混匀颠倒混匀4-6次次中和液中和液S3350l温和地温和地颠倒混匀颠倒混匀6-8次次12，000rpm10 min室温静置室温静置35min至出现白色至出现白色絮状沉淀絮状沉淀取取600l上清至上清至吸附柱管吸附柱管12，000rpm30s12，000rpm30s洗涤液洗涤液W600l12，000rpm30s12，000rpm2 min取吸附柱至取吸附柱至另一新另一新EP管管洗脱液洗脱液50l12，000rpm1 min室温静置室温静置1min弃滤液弃滤液空柱空柱收集洗脱液备用收集洗脱液备用洗涤液洗涤液W600l弃滤液弃滤液弃滤液弃滤液加入洗脱液加入洗脱液加入洗涤液加入洗涤液W二、质粒二、质粒DNA定量测定定量测定利用核酸在利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性处有紫外吸收的特性基本原理基本原理紫外分光光度计紫外分光光度计操作步骤操作步骤1.取取5 l提取的质粒提取的质粒DNA，加入，加入95 l蒸馏水蒸馏水2.混合均匀混合均匀3.用紫外分光光度计测定用紫外分光光度计测定A260DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸紫外光吸收法紫外光吸收法：DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0DNA或或RNA的纯度判定的纯度判定三、质粒三、质粒DNA的酶切分析的酶切分析 质粒质粒 DNA:3 kb 载体载体:pMD18-T 2.7kb 基因基因:CHD5 1.4 kb 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列限制酶识别序列的的特殊特殊DNA序列之内或其附近的序列之内或其附近的特异位点特异位点上，并在此上，并在此切切割双链割双链DNA。分子克隆中常用的为分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为型限制酶，其识别位点长度为46个核苷酸的个核苷酸的反向重复序列反向重复序列。限制性内切酶限制性内切酶GGATCCCCTAGGEcoR和和Hind的识别序列和切口是：的识别序列和切口是：EcoR：GAATTC Hind：AAGCTTpMD18-T反应物反应物 10 M 酶切缓冲液酶切缓冲液质粒质粒DNA Hind IIIEcoR IH2O 体积（体积（l)2 10 1 1 6在一个洁净的在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：离心管中混匀下列反应物：混合后混合后37 水浴水浴12h质粒质粒DNA的酶切分析操作的酶切分析操作1234影响酶切反应的因素影响酶切反应的因素底物底物DNA的纯度的纯度反应系统：反应系统：(反应缓冲液反应缓冲液)反应体积：反应体积：甘油浓度甘油浓度5%保温时间与温度保温时间与温度四、琼脂糖凝胶电泳四、琼脂糖凝胶电泳电泳：电泳：带电粒子在电场中泳动的现象带电粒子在电场中泳动的现象影响迁移率的因素？影响迁移率的因素？电场电场样品：样品：大小（分子量）大小（分子量）形状（构型）形状（构型）电荷电荷共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNA线性线性DNA开环的双链环状开环的双链环状DNA质粒质粒DNA三种构型：三种构型：共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋线性线性开环的双链环状开环的双链环状琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖（琼脂糖（Agarose）是一种多聚糖，由半乳糖）是一种多聚糖，由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖透明无紫外吸收透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。支持物进行平板电泳。胶浓度（）胶浓度（）线性线性DNA分子大小分子大小（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13本次电泳使用本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度与琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围分子的有效分离范围 琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备 上样：上样：加样前，样品先与加样前，样品先与6上样缓冲液混匀上样缓冲液混匀 电泳电泳：电压电压100v；30min 结果观察：结果观察：凝胶成像仪凝胶成像仪 琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1.凝胶准备凝胶准备 称称1g琼脂糖置三角瓶中，加琼脂糖置三角瓶中，加0.5TBE 100ml；微波炉加热大约微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；分钟，熔化琼脂糖；2.胶床准备胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有有1mm的间隙；的间隙；将胶床放在调整好的水平台上；将胶床放在调整好的水平台上；3.铺胶：将冷却至铺胶：将冷却至60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约度约5 mm；4.室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使使样品孔位于电场负极样品孔位于电场负极；5.向电泳槽中加入向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；6.轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；7.样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀；用加样器轻轻混匀；8.上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为加样量为6 l；9.盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；10.电泳条件：电压电泳条件：电压80v；时间；时间2530分钟；分钟；11.电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结束后，切断电源，取出凝胶。12.电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带 13.取出凝胶，置于取出凝胶，置于凝胶成像仪凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。中观察结果，并拍照记录。琼脂糖凝胶电泳上样琼脂糖凝胶电泳上样1：DNA Marker（5 l）2：提取的质粒：提取的质粒DNA（5 l）3：质粒：质粒DNA酶切产物酶切产物（10 l）+-1234每组上每组上2个样品个样品DNA Marker (ladder)Loading Buffer上样缓冲液上样缓冲液 EDTA 甘油甘油 增大溶液密度增大溶液密度 溴酚蓝溴酚蓝指示剂指示剂 二甲苯胺蓝二甲苯胺蓝指示剂指示剂组成组成0.5TBE,0.5-1.4%浓度的胶中，浓度的胶中，迁移率迁移率 溴酚蓝溴酚蓝=300bp 二甲苯胺蓝二甲苯胺蓝=4kbp 染色染色溴化乙锭溴化乙锭(EthidiumBromide，EB):3,8-二二氨基氨基-5-乙基乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射在紫外光照射下呈现红橙荧光下呈现红橙荧光,优点：优点：染色操作简便，快速；灵敏度高染色操作简便，快速；灵敏度高缺点：缺点：有致癌性有致癌性(使用时一定要戴手套使用时一定要戴手套)1 2M3 45 6 75