血清蛋白质含量的测定.ppt

No.3 血清总蛋白含量的测定血清总蛋白含量的测定1实验目的实验目的1.熟悉血清总蛋白的测定方法熟悉血清总蛋白的测定方法（双缩脲法）（双缩脲法）2.掌握血清总蛋白测定的临床意义掌握血清总蛋白测定的临床意义2血清总蛋白血清总蛋白血清蛋白血清蛋白球蛋白球蛋白白蛋白白蛋白3550g/L2040g/L3蛋白质含量测定的几种方法方法方法灵敏度灵敏度时间时间原理原理 说明说明凯氏定氮凯氏定氮法法（Kjedahl法）法）灵敏度灵敏度低低费时费时 810小小时时将蛋白氮转化为氨，将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定用酸吸收后滴定用于标准蛋白质含量的准确用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长测定；干扰少；费时太长双缩脲法双缩脲法（Biuret法）法）灵敏度灵敏度低低中速中速 2030分分钟钟多肽键碱性多肽键碱性Cu2 紫色络合物紫色络合物用于快速测定，但不太灵敏；用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似不同蛋白质显色相似紫外吸收紫外吸收法法较为灵较为灵敏敏快速快速 510分分钟钟蛋白质中的酪氨酸蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在和色氨酸残基在280nm处的光吸收处的光吸收用于层析柱流出液的检测；用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正核酸的吸收可以校正4方法方法灵敏度灵敏度时间时间原理原理说明说明Folin酚酚试剂法试剂法（Lowry法）法）灵敏度高灵敏度高5 g慢速慢速 4060分钟分钟 双缩脲反双缩脲反应；磷钼应；磷钼酸磷钨酸磷钨酸试剂被酸试剂被Tyr和和Phe还还原原耗费时间长；耗费时间长；操作要严格操作要严格计时；计时；颜色深浅随颜色深浅随不同蛋白质不同蛋白质变化变化考马斯亮考马斯亮蓝法蓝法(Bradford法法)灵敏度最灵敏度最高高15 g快速快速515分分钟钟考马斯亮考马斯亮蓝染料与蓝染料与蛋白质结蛋白质结合时，其合时，其 max由由465nm变为变为595nm最好的方法；最好的方法；干扰物质少干扰物质少；颜色稳定；颜色稳定；颜色深浅随颜色深浅随不同蛋白质不同蛋白质变化变化5凯氏定氮法（图）凯氏定氮法（图）6凯氏定氮法凯氏定氮法样品中的样品中的有机氮有机氮浓硫酸浓硫酸催化剂催化剂无机铵盐无机铵盐+OH-NH3用酸吸收用酸吸收根据酸的增重算出样品中氮根据酸的增重算出样品中氮的含量的含量7紫外吸光光分度计紫外吸光光分度计8Folin酚试剂酚试剂9考马斯亮蓝考马斯亮蓝10实验原理实验原理双缩脲双缩脲+双缩脲试剂双缩脲试剂紫红色络合物紫红色络合物双缩脲试剂双缩脲试剂11相似的相似的肽键肽键+双缩脲试剂双缩脲试剂紫红色络合物紫红色络合物 血清总蛋白的吸光度在一定浓度范围内和样品中血清总蛋白的吸光度在一定浓度范围内和样品中蛋白质的浓度成正比，同蛋白质标准液比较后，即蛋白质的浓度成正比，同蛋白质标准液比较后，即可求得蛋白质的量。可求得蛋白质的量。12注意！注意！1.双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色双缩脲反应并非是蛋白质特有的颜色反应！反应！2.凡分子内含有凡分子内含有2个或个或2个以上甲酰基氨个以上甲酰基氨基（基（-CONH2-）均可呈双缩脲反应。均可呈双缩脲反应。NHCOCH33HCCONH如：如：13实验试剂实验试剂1.生理盐水：生理盐水：NaCl 0.9g 溶于溶于100ml蒸馏水蒸馏水2.双缩脲试剂：硫酸铜双缩脲试剂：硫酸铜 3.0g溶于溶于500ml蒸馏蒸馏水，加水，加酒石酸钾钠酒石酸钾钠9.0g,碘化钾碘化钾5.0g，完全，完全溶解后，加入溶解后，加入24%NaOH100ml，用蒸馏水，用蒸馏水稀释到稀释到1L，置聚氯乙烯瓶内盖紧保存。，置聚氯乙烯瓶内盖紧保存。3.蛋白质标准液：收集混合血清，经蛋白质标准液：收集混合血清，经凯氏定凯氏定氮法氮法定值，用作蛋白质标准液。贮于冰箱定值，用作蛋白质标准液。贮于冰箱中备用。也可用中备用。也可用100mg/ml牛血清白蛋白替牛血清白蛋白替代。代。4.待测血清用生理盐水待测血清用生理盐水1:10稀释。稀释。14注意注意收集的血清要求收集的血清要求无黄疸无黄疸，无溶血无溶血，乙型乙型肝炎表面抗原阴性肝炎表面抗原阴性，肾功能正常。肾功能正常。黄疸黄疸溶血溶血 乙型肝炎乙型肝炎15WHY?黄疸黄疸：肝功能不正常；（肝脏是合成蛋白：肝功能不正常；（肝脏是合成蛋白质的重要场所）质的重要场所）溶血溶血：如红细胞中的血红蛋白被释放到血：如红细胞中的血红蛋白被释放到血液中，使测量值偏大液中，使测量值偏大血清蛋白质是各种蛋白的复杂血清蛋白质是各种蛋白的复杂混合物混合物，含有含有 白蛋白白蛋白、a1、a2、球蛋白球蛋白，纤维蛋纤维蛋白原白原，凝血酶原凝血酶原等等16实验操作实验操作测定管测定管 标准管标准管 空白管空白管 血清（血清（ml）1.00蛋白质标准液（蛋白质标准液（ml）1.00生理盐水（生理盐水（ml）1.00双缩脲试剂（双缩脲试剂（ml）5.0 5.0 5.0 取取3支试管，按下表操作：支试管，按下表操作：混匀，混匀，37度度水浴水浴10分钟，以分钟，以空白管空白管调零，调零，540nm波长处进行比色，分别读出各管波长处进行比色，分别读出各管的吸光度。的吸光度。17计算公式计算公式根据根据血清总蛋白浓度血清总蛋白浓度C=A/E蛋白质标准液浓度蛋白质标准液浓度=A测测/A标标得得血清总蛋白含量血清总蛋白含量=浓度浓度X稀释倍数稀释倍数血清总蛋白含量血清总蛋白含量=（A测测/A标）标）X蛋白质标准液浓度蛋白质标准液浓度X稀释倍稀释倍数数18临床意义临床意义1.清总蛋白增高：清总蛋白增高：血液浓缩：腹泻、呕吐等。血液浓缩：腹泻、呕吐等。合成增加：如多发性骨髓瘤等。合成增加：如多发性骨髓瘤等。2.清总蛋白降低：清总蛋白降低：血液稀释：过多注射低渗溶液，各种原因血液稀释：过多注射低渗溶液，各种原因引起的水钠潴留。引起的水钠潴留。摄入量不足和消耗增加：营养不良、慢性摄入量不足和消耗增加：营养不良、慢性肠胃炎、严重结核病等。肠胃炎、严重结核病等。合成障碍：肝脏疾病。合成障碍：肝脏疾病。蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，肾综合症等。肾综合症等。19注意事项注意事项1.双缩脲试剂中双缩脲试剂中酒石酸钾钠酒石酸钾钠的作用是络合铜离的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘碘化钾化钾能防止两价铜离子还原。能防止两价铜离子还原。2.由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用度不宜用mol/L表示。表示。3.高脂，黄疸及溶血标本应做血清空白对照来高脂，黄疸及溶血标本应做血清空白对照来校正误差。含脂类极多的血清，加入双缩脲试校正误差。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行抽提后再进行比色。比色。4.在浓度小于在浓度小于100g/L时呈良好的线性关系。时呈良好的线性关系。20