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2022高通量测序技术的临床应用及常见问题(全文)近年来，随着测序技术、生物信息学分析的迅猛发展，高通量测序，又称下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)技术在精准医学中的应用不断深化，主要体现在感染性疾病检测、肿瘤基因检测及伴随诊断、遗传性疾病诊断等方面。测序技术的出现，直观而深刻地揭露了核酸分子的深层信息，为人类进一步探索人类疾病提供了决定性的技术手段。但是，由于NGS检测步骤繁琐、流程复杂，对结果分析解读要求高，具有一定局限性。一、NGS技术在临床上的应用1.NGS技术在感染性疾病诊断中的应用：感染性疾病仍是全球范围发病和死亡的重要因素，病原学诊断对感染性疾病的精准诊疗具有重要的意义。NGS技术在微生物检测中的应用主要包括：(1)宏基因组二代测序mNGS宏基因组二代测序mNGS(metagenomicnext-generationsequencing)能够直接检测患者标本中的所有遗传物质，包括样本中多种类型的病原体，如细菌、分枝杆菌、RNA和DNA病毒、酵母、霉菌等。研究表明：mNGS能够成功鉴别诊断多个部位的感染，包括中枢神经系统、血液、呼吸道、胃肠道、泌尿生殖系统等。缺点是检测过程复杂，步骤繁多，缺乏标准化。(2)多重靶向测序tNGS多重靶向测序tNGS(targetednext-generationsequencing)是基于超多重PCR和二代测序技术的新型病原微生物检测方法,可用于检测多种类型的已知病原体，包括细菌、病毒、真核生物，其优点是特异性和灵敏度高、性价比高，能同时对特定物种的耐药基因及毒力因子基因进行分析,周转时间短等；缺点是检测范围有限，无法识别新的病原体或耐药位点。(3)全基因组测序WGS全基因组测序WGS(who1.egenomesequencing)能够对整个病原体基因组进行测序，识别抗生素耐药谱，从而为临床用药提供依据。缺点是大部分细菌测序需要进行分离培养，去除其他微生物的污染。虽然WGS检测能够准确检测已知的耐药基因，但新发突变对表型的影响给检测结果带来了许多不确定性。2. NGS在肿瘤诊断、靶向治疗以及预后监测中的应用：NGS可用于肿瘤诊断,识别癌症中常见的基因变异，包括单核甘酸变异(sing1.enuc1.eotidevariation,SNV小片段插入缺失、拷贝数变异(copynumbervariation,CNV)以及某些恶性肿瘤中的融合基因。目前靶向基因测序是临床实验室肿瘤诊断的首选方法，与全基因组测序(who1.e-genomesequencingzWGS)与全外显子测序(who1.e-exomesequencing,WES)相比，具有测序质量高、结果易分析、成本效益低和周转时间短等优势。NGS还用于液体活检中循环肿瘤DNA(circu1.atingtumorDNA,CtDNA)的检测，国内专家共识建议可应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期实体肿瘤的伴随诊断、靶向耐药机制的识别以及预后监测等。3. NGS在遗传病诊断中的应用：NGS技术的发展逐渐改变了遗传疾病诊断的方式。传统遗传病的研究方法是从临床表型到基因型分析，即所谓的正向遗传学研究方法。随着NGS技术的发展，形成了以遗传信息为基础确定表型的反向表型研究方式，使临床医生能够根据个体的遗传变异准确预测疾病及相关临床表现。根据不同文库构建方式，可分为全基因组WGS,全外显子WES,医学外显子、靶向基因测序等。常用的研究方法包括：(1)使用WES或WGS分析具有相同临床特征的一组患者，可筛选出不同患者中的相同变异；(2)先证者与父母或其他家庭成员同时进行WES或WGS分析，可根据疾病遗传模式(常染色体显性、隐性、X连锁或新发变异)筛选出致病变异。二、NGS在临床应用中存在的问题随着分子生物学和科学技术的不断提高，高通量测序技术在短短20年内取得了突飞猛进的发展,特别是精准医疗概念的提出，使高通量测序技术成为精准医疗的重要技术保障。尽管如此，高通量测序平台依然存在许多亟待改进和完善之处。1. 目前主流的高通量测序平台序列读长较短，且依赖于PCR扩增技术,容易造成读取序列的误差与偏好性，给后期生物信息学数据分析处理造成了较大的困难，从而影响结果的检出。2. NGS结果解读高度依赖后续生物信息学分析。目前基于NGS数据的分析流程仍处于不断更新完善阶段，标准化程度有待提高。3. NGS检测结果分析与判读易与临床脱节，造成结果的偏差，进而影响治疗。展望作为一项具有划时代意义的技术，NGS极大推动了精准医学的发展，被广泛应用于感染性疾病诊断、遗传病筛查、肿瘤临床诊断、药物基因组学检测、单基因疾病筛查或诊断、癌症的化疗与治疗等方面，为实现患者的个体化临床诊疗奠定了基础。同时，NGS在实际应用中也面临诸如检测流程及质量管理体系不完善、结果分析与临床脱节等问题。随着技术的不断发展与完善、相关应用指南与规范的逐步出台，相信NGS技术将更好地服务于精准医疗实践。参考文献1 .鲍芸，肖艳群，王华梁.高通量测序技术的临床应用及质量管理.中华检验医学杂志，2022z45(1.1.):1099-1103.2 .姜晓峰.高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望.检验医学,2017,32(4):250-254.美格医学助力临床精准抗感染：(1)宏基因组二代测序mNGSMagiSeqmNGS项目检测范围基于能提供广域搜索、并持续更新的参考基因组数据库，包含约有60万+株微生物参考基因组，检测展示的结果主要来源于经过细致整理、可精确鉴定的微生物种类数据库，总共23796种。其他包括：支原体、衣原体、立克次氏恨埃立克体、练旋体等图：mNGS检测范围(2)多重靶向测序tNGStNGS是mNGS技术的补充，解决mNGS受人源基因组及背景菌基因组干扰的问题；解决mNGS对结核、真菌、胞内菌等检出率低的问题；解决mNGS检测技术对RNA病毒检测难度大的问题；解决mNGS对耐药基因及毒力因子基因检测难点的问题。图：tNGS检测范围，206裨病原经生物将测/耐药基因检测，432种病原健生物检测/耐药基因桧溉,西力因子基因桧测/45种分枝秆国国种壑定/抗结核耐药基因检测，抗非结核耐药豆因椅费基础版升级版高级版分枝杆菌版注：其它包括支原体、衣原体、立克次体、骞旋体等病原微生物