微生物培养技术.ppt

微生物微生物非细胞生物：病毒非细胞生物：病毒原核生物：细菌、放线菌、支原体、原核生物：细菌、放线菌、支原体、 立克次氏体立克次氏体真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）菌落：菌落： 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。细菌的营养类型细菌的营养类型 根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。细菌分为两大营养类型。 自养型自养型: : 异养型异养型: : 腐生菌腐生菌 寄生菌寄生菌 光合自养型光合自养型:光合细菌光合细菌化能自养型化能自养型:硝化细菌硝化细菌一、微生物的分离和纯培养一、微生物的分离和纯培养（3 3项技术项技术1 1个案例）个案例） （一）培养基配制技术（一）培养基配制技术（二）无菌技术（二）无菌技术（三）接种技术（三）接种技术 案例：大肠杆菌的分离和纯培养案例：大肠杆菌的分离和纯培养 1 1、培养基定义、培养基定义：（课本第：（课本第2 2页）页）2 2、营养构成：、营养构成：环境条件：环境条件：pHpH、氧气、二氧化碳、渗透压等、氧气、二氧化碳、渗透压等 （一）培养基配制技术（一）培养基配制技术营养成分：营养成分：水水、无机盐无机盐、碳源碳源、氮源、生长因子氮源、生长因子固体培养基固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等用于菌种分离、鉴定菌落等半固体培养基半固体培养基可观察微生物的运动可观察微生物的运动液体培养基液体培养基常用于发酵工业。常用于发酵工业。（1 1）按物理状态分：）按物理状态分：固体培养基固体培养基和和液体培养基、半固体培养基液体培养基、半固体培养基。3.3.培养基的分类培养基的分类固体培养基固体培养基平板培养基（课本第平板培养基（课本第2页）页）斜面培养基斜面培养基固体培养基中需加入凝固剂，如固体培养基中需加入凝固剂，如琼脂琼脂半固体培养基半固体培养基无运动无运动 有运动有运动 半固体培养基中也需半固体培养基中也需要加入凝固剂琼脂，但加要加入凝固剂琼脂，但加入量少于固体培养基。入量少于固体培养基。液体培养基液体培养基表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长选择培养基选择培养基（2 2）按功能分：）按功能分：选择培养基选择培养基和和鉴别培养基鉴别培养基加入加入青霉素青霉素的培养基的培养基:抑制细菌和放线菌的生长，抑制细菌和放线菌的生长， 分离分离酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌等真菌。等真菌。 不加氮源不加氮源的的无氮无氮培养基培养基: : 分离分离固氮菌固氮菌定义定义（课本第（课本第7页）页）举例：举例：加入加入高浓度食盐高浓度食盐的培养基的培养基: :分离分离金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌鉴别培养基鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同鉴别不同种类的微生物种类的微生物。 例如：在培养基中加入例如：在培养基中加入伊红和美蓝伊红和美蓝，可以用来，可以用来 鉴别鉴别大肠杆菌大肠杆菌。 如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝 结合，结合，使菌落呈蓝紫色，并带有金属光泽使菌落呈蓝紫色，并带有金属光泽。 ( (课本课本1515页页) ) 用用化学成分已知的化学物质化学成分已知的化学物质配成的，因成分明确，配成的，因成分明确，常用于分类、鉴定等常用于分类、鉴定等 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。合物、无机盐和其它一些辅助物质。合成培养基合成培养基: :天然培养基：天然培养基：（3 3）按成分分：）按成分分：合成培养基合成培养基和和天然培养基天然培养基 用化学成分不明确的天然物质配用化学成分不明确的天然物质配成的，如血清、成的，如血清、组织提取液等组织提取液等称量：称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较黏稠，准确地称取各种成分。牛肉膏比较黏稠， 可以用玻棒挑取，放在可以用玻棒挑取，放在称量纸称量纸上称量。牛上称量。牛 肉膏和蛋白胨都肉膏和蛋白胨都容易吸潮容易吸潮，称量时，称量时动作要动作要 迅速迅速，称后要，称后要及时盖上瓶盖及时盖上瓶盖。4.4.培养基的配制步骤（第培养基的配制步骤（第8 8页）页）（1 1）. .计算计算: :根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的 比例，计算配制比例，计算配制100mL100mL的培养基的培养基 时，各种成分的用量。时，各种成分的用量。 （参考课本（参考课本8383页培养基配方）页培养基配方）（以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例）（以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例）（2 2）. .溶化：溶化：加水加热熔化牛肉膏加水加热熔化牛肉膏 将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯加入少量的将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯加入少量的 水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分 离后，用玻棒离后，用玻棒 取出称量纸。取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解；加入蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解；加入琼脂；加入琼脂；用蒸馏水定容到用蒸馏水定容到100mL100mL。 整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。底而导致烧杯破裂。（3 3）. .调节调节pHpH（4 4）. .分装、包扎分装、包扎（5 5）. .灭菌灭菌（6 6）倒平板）倒平板待培养基冷却到待培养基冷却到50 50 左右时，在酒精灯附近倒平板。左右时，在酒精灯附近倒平板。倒平板倒平板在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培 养皿，立刻盖上皿盖。养皿，立刻盖上皿盖。待平板冷却凝固后，将平板待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置倒过来放置。（二）无菌技术（二）无菌技术 无菌操作泛指无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。止杂菌污染的方法。、消毒消毒（1 1）定义：）定义：使用较为使用较为温和温和的的物理或化学物理或化学方法仅杀死物体方法仅杀死物体 表面或内部一部分对人体有害的微生物（不表面或内部一部分对人体有害的微生物（不 包括芽孢和孢子）包括芽孢和孢子）A A、煮沸消毒法煮沸消毒法:100:100煮沸煮沸5-6min5-6minB B、巴氏消毒法巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min 或或 80 80 下煮下煮15min15minC C、化学药剂消毒法化学药剂消毒法: :用酒精进行皮肤消毒用酒精进行皮肤消毒; ; 氯气消毒水源氯气消毒水源D D、射线消毒法射线消毒法（2 2）消毒的方法：）消毒的方法：（1 1）定义：）定义：使用使用强烈的理化因素强烈的理化因素杀死物体内外所有的杀死物体内外所有的 微生物，微生物，包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子 。2 2、灭菌、灭菌（2 2）灭菌的方法：）灭菌的方法：A A、灼烧灭菌、灼烧灭菌C、高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌： 100kPa、121 下维持下维持 15-30min.B、干热灭菌：干热灭菌： 160-170 下加热下加热1-2h。（三）接种技术（三）接种技术（课本第（课本第2 2页页）1.1.定义定义2.2.平板培养基上接种方法平板培养基上接种方法平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法 平板划线的操作方法平板划线的操作方法连续划线法连续划线法交叉划线法交叉划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的将菌液进行一系列的梯度稀释梯度稀释，然后将，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。基的表面，进行培养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。养基表面形成单个的菌落。1、微生物实验室培养的基本操作程序、微生物实验室培养的基本操作程序（1 1）器具的灭菌）器具的灭菌 （2 2）培养基的配制）培养基的配制（3 3）培养基的灭菌）培养基的灭菌 （4 4）倒平板）倒平板（5 5）微生物接种）微生物接种 （6 6）恒温箱中培养）恒温箱中培养（7 7）菌种的保存）菌种的保存（四）案例：大肠杆菌的分离和纯培养（四）案例：大肠杆菌的分离和纯培养 （1）制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基2 2、大肠杆菌的分离和纯培养步骤、大肠杆菌的分离和纯培养步骤（2)2)配制培养基：计算称量；熔化；配制培养基：计算称量；熔化； 调调PHPH；分装；分装； 灭菌；灭菌； 倒平板倒平板 （3 3）接种：平板划线法；稀释涂布平板法。）接种：平板划线法；稀释涂布平板法。（4 4）培养：）培养： 倒置倒置，3737恒温箱，恒温箱，1212和和24h24h。（5 5）纯化培养：）纯化培养：倒置倒置，3737恒温箱，恒温箱，24h24h。（6 6）菌种保藏：临时、长期保存法。）菌种保藏：临时、长期保存法。 1 1、临时保藏临时保藏：接种到固体斜面培接种到固体斜面培养基，菌落长成后养基，菌落长成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。 2 2、长期保存长期保存：甘油冷冻管藏法甘油冷冻管藏法-20 -20 冷冻箱保存冷冻箱保存二、培养基对微生物的选择作用二、培养基对微生物的选择作用（一）、基础知识（一）、基础知识1 1、纤维素与纤维素酶、纤维素与纤维素酶【案例】分解纤维素的微生物的分离【案例】分解纤维素的微生物的分离纤维素是一种多糖纤维素是一种多糖纤维素酶是一种复合酶纤维素酶是一种复合酶纤维素纤维素纤维二糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶（二）、筛选（二）、筛选1 1、方法：、方法：刚果红染色法刚果红染色法原理：刚果红（原理：刚果红（CRCR）可以与纤维素形成）可以与纤维素形成红红 色复合物色复合物，当纤维素被，当纤维素被纤维素酶分纤维素酶分 解解后，红色复合物无法形成，出现后，红色复合物无法形成，出现 以纤维素分解菌为中心的透明圈以纤维素分解菌为中心的透明圈， 我们可以通过是否产生透明圈来筛我们可以通过是否产生透明圈来筛 选纤维素分解菌。选纤维素分解菌。常用的刚果红染色法有两种常用的刚果红染色法有两种方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖1mg/mL1mg/mL的的CR CR 溶液，溶液，1015min1015min后，倒去后，倒去CRCR溶液，加入溶液，加入 1mol/L1mol/L的的NaClNaCl溶液，溶液，15min15min后倒掉后倒掉NaClNaCl溶液。溶液。方法二：配制质量浓度为方法二：配制质量浓度为10mg/mL10mg/mL的的CRCR溶液，灭菌溶液，灭菌 后，按照每后，按照每200mL200mL培养基加入培养基加入1mL1mL的比例加入的比例加入 CRCR溶液，混匀后倒平板。溶液，混匀后倒平板。一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红另一种是在倒平板时就加入刚果红（1 1）土壤取样）土壤取样 （2 2）选择培养（可省略）选择培养（可省略） （3 3）梯度稀释）梯度稀释 （4 4）涂布培养）涂布培养 （5 5）挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落（6 6）微生物培养（纯培养）微生物培养（纯培养