微团细胞培养步骤.docx

雄雄鼠交配后其次天7:00视察阴栓，看到阴栓当日记为孕0”孕12d脱颈处死，消毒后剖腹，取出子宫后将子宫在DHanks液中和洗至无血色（约3遍）后，分别出胚胎，要轻轻剥离，W?意银子不要夹到胚胎，倒D-Hank1S液在超净台中完成,倒前瓶子要在酒精灯上烧一下，孟瓶孟前也要将瓶美和瓶口在酒塔灯上烧一下.格胚胎在D-Hank's液中涮洗至没有血液（约3遍），将胚胎转移至371、的D-Hank6液中，于解剖显微镜下分别前后肢芽或中脑等须要的组织，并将所需组织用吸管吸到另一个平皿中。全过程不是在超净台内，但要留意无菌操作，所用蹑子留意在酒精灯上烧一下.假如在分别组织时，将分别下的组织吹散或与其他无用的组织混合而不易分别，则弃之，肯定不要吸上杂质，若平皿中组织碎块太多就换平皿.将放有组织的平皿移至超净台中，将组织吸入10m1.试管EP管中，用D-Hanks液冲洗3遍，每次尽量将管中液体洗干净，但留意不要吸走组织.消化：加入0.5%胰果白酶，加上管孟,于37T孵育IOmin.加入HamgF12完全培育液终止肖化,此时组织成粘稠的絮状，洗3次，要求同上，前2次无需定Ifi,最终一次加须要的体枳（如：1m1.）.用200p1.移液枪头反豆吹吸黏稿的组织块，至组织块完全吹散，即成细胞悬液.用Im1.针管（去针头）吸上全部细胞层液，过200目细胞筛,用台给蓝记数，细胞存活率在90%以上（；舌细胞镜下透亮,不染色）,调整悬液细胞浓度（肢芽细胞浓度为21071.,中脑细胞51.0m1.）于96孑饭每孔正中加入10纽胞悬液，放人培育箱中2-3h后给药.须要用通2的培育箱，放入前要用75%酒精消苗.加药时不同组用不同的试管正P管配药，药在最初配制时须为终浓度的100倍，在加药前，用HamgFI2完全培育液将所需药配好,加药量为200川孔.放入培育箱中培育5d.5d后进行MTT染色，即每孔加入5mgm1.的MTT渊I（M,后放入培育箱中培育4h.吸去培育液，加入DMSo（二甲基亚碾）1001.1于570nm处测吸光值.加入Hank's-F12完全培育液（小牛血清:谷氨酰胺:吉密素:链霉素为88:10:1:1）终止消化