光调控下花生疮痂病菌毒素对花生生理生化特性影响.docx

第三章花生疮IS病毒案对花生生理生化特性影响Wi物柄害是H1.物与嫡麻菌相互作用的结果,我磔旃若要成功侵入植物引致病科,必须突破加物体内防加反应，例如植物先天所具仃的治理依碍，用麻房和细胞纸，以及植物疆知化学信号E引发月部细但死亡的过政性坏死反应等，向病依做在与植物K期的进化和乂杂的作过程中.已线演变了无数策略以逃意免段防御.并逐渐形成对桢物致病的复杂机做.长期以来在对K1.物场除玩的数场机制的研究过程中发现，桁15!菌可产生激素、毒素、母类和蛋门类等致病囚子，对病母前的侵入、定植物期至关S1.要的作M,而近年来对泗原储狗术的作用方式、与希欣曲间的相互作川以及利川毒索进行植物抗徜性丛种电定成为植物阴理学研究的热点.白涔索在20世纪4。年代件次发现以来.已有大加关于净素的报道，*!H对其遗一步深入的研九发现，不同病顺的毒素时寄主植物的致物机理.作用位点和作用方式均有期必不同柑橘植恪也产生ACR而底可作用于需主植物的能粒体,例澈NADH的翅化，抑制娥珀酸或华果酸的料化,导致呼吸作用的辄化WI酸化肘畏我.我终使桀值秒止呼吸.并引起线粒体的损伤.CgwXKin为星他苗屉病磔曲产生的英J1.行光敏政海作用的花AK类桩点.活性H作为其玳要揖害方式,可引起由主制的腹过nI化,电化学势肾低，导致剂型破裂.活性辄是出物在前原的入侵后产生的一类飙化还味性极强的中间产物,包括过班化粗.祕辄阴圉子和单线密辄等.但除了寄I：植物能弊产牛.活性翅并用我抵御徜原由外.类山尾饱曲肮、构成腔范M等出魄荒产生的共存光破特性的花K5类K蔺海卷也可人此产生.并作为该病陆帝致鹤过程中的!R要厚力方式.物眈也肮作为S1.要种16'ft前可引致他勃照1钠、柑橘疮如衲和花生疮糊物等娈他再，由其产生的Jii襄脖位*已被证叨是柑橘舱布疏於致病中的第，空伟力因予.向的&Jfi点前花生掩版晒中尚未存毒器钗病机理的相关报道.花生把痴病为近曾来新流行病宙.在:山东.河M.河北.安政、广东、tt苏和辽宁等花生土产区均有危富,并田大面积扩收的总势，已成为我国花生产业中M为产术的物古，明确&ftKHV1.案在花生效也病倒致祜过程中的作用.痈定ROS是否8与花生布凝用的发展.对同明梅京的作用机即做外克.为从根本1.-.W)ifftt1m定理论生砒.1 ttM¾t1.1 材料与处供试朋泉曲为花生旗明涧做39),供试花生为辽宁曾主裁出种“白沙1016”，为花生疮01假劣斑品种.病朦菌奇案提取液参考1.iaO等定方法,设置毒案的浓度.以内阳为口出对照.以水为空向对照，针刺法接种,接种后均套袋保涅，分别于0,2,4,8,12,24.36,48.60.72,84.%h取样,枢处理戒狂3次12W含*N定1.2.1HR*T*取。38叶片加入pH7.8.65nutx>1.'1.的2酸缓冲液.冰浴研典成匀浆后褥心(25<)0xs10mini.取上梏液1m1.加0.1m1.次胺乳化卷(IOmmot1.>.在25IeKjfi20min后加入17mtn()1.1.的对5桂米硝酸Im1.和7mmo1.1.的茶胺Im1.25"C下14反!42Omin。反应后乙处抽提.取水枪液罚A53O.MNG做标准曲妓,每处即/3次.122过H化氢神取Ig叶片川3m1.冷内修磨成勾浆后阳心(160WX£.IOmin).上游液定容.反腹液中含0.1m1.20%(V/V)TiCh的浓慈酸,0.2m1.浓氨水和Im1.上消液.生成的过氧化物TiH合物用丙用洗5次，丙用挥发后溶于3m1.tttt()moV1.)中，测定A*m>.按同样程序制HQ标准曲线.而处理坂复3次.1-'语伊。R化学定位果用二M总我米胺(DAB)而此。:的产生进行组织内定位.F取样时间以前8h将接种的花生叶片的F.慢入到含Imgm1,DAB的水涔液中(pH3.8).之后.格叶片在95%的乙醇溶液中五潦IOmin送行固定和脱色.恃叶绿素完全横去后将叶片置于悒和水5W5中透明.50%的甘油中保存.6的祖次化学定他采用氮乾四叶(NBT)组织染色法.将叶片放入含TJ0.1%NBT(wv)的IOmM7酸缓冲液中(pH7.8)氏空海选20min.脱色与保存方法向上.好处理联复3次，1.3活性锄f*活性,定1.”般的提取叶片稔取0.兄.用含有ImMEDTA和5%(wv)PVP的100mM畸酸伴级冲液(pH73)研磨成匀浆IOCW富心30min,吸取上酒液定容至5m1.fCOT俅存备用.APXH1.ft>ft1Sm1.SOinM脩酸缓冲液(1.mMt1.1.ImMEDTA.2%PVP.pH7.0)132超辄化物歧化陋(SOD)3m)反应滋合液：JOmM勘取拈缓冲浪pH7.8.13mM1.f1.75mMNBT.2mM住黄<.ImMEDTA.20m1.粗薛液.核黄素最后加入.与黑麻中.在光中反应IOmin后在56Onm处记杀:吸光度，以不光照的试行为对照，以NBT还境受抑制5。”为一个的活总值.NH度抑;M-Afj",100儿”.3,133过辄化制1.<CAT>取1.Sm1.的2R缓冲液(pH7.8).加入1.Um1.蔡恰水、0.3m1.H：O：(0.1inob'1.)f1.0.1m1.租ftift,对照组用0.0SnWV1.的磷酸后冷液代曲.每分除器定240nm下的OD值，血SI3次，以OD值每降低0.0436为一个防活里位.CAT酣活性(U)=0.0436×Wxi随提取液忌状("1.)版液用ht（三）公式中：R为反应时间内吸光度的变化:W为样t?电(g):I为反应时间unm).ttIBM户I：E1.M2缈FIB.HUSM.NCW>.e<j.1.idpc)i*1.<k<AidMjs<uidc(Uik!ttk<«1ccrA-pnIVYrUututubU»kaveinf1.n1.wthMufcnhnpNir*OrEIhernh«nmoMKVmIJ.PysN(kM&Mo1.c<ubrPhPb>1.(¾y.199».4J2XIWIIMMftWI户注GH*11r(>I,<；nm»PntmiiiJ.rt>frVjt<:“dcbM23mwnim>11nf<mMn1JkdK4dehd,(crtnctr«n1.umUwm.“kff(JPan*.1992.1M<I1.:48-53.活性找定警考E1.MEhaty|西等的方法13.4过粗化物阱(POD)活性按照Goffncr淋222.9m1.0.05mo1./1.磷酸缓冲液.I。m1.2HQ1.0m1.0Q5mo1./1.愈创木船利0.1m1.1.%ift.于37X?水浴中保温15min.秋后迅速浓浴.稿定47Onm的吸光收.以圻分种内A470变化0.01为一个筋活W)Dtt5n(I)三A陶杜取液晶出(江>PODM'"性(U)-00,w1.×ft,1.1.4丙二B(MDA)含量,定MftIMM1.户峰Dtiira1.MRS.Hum1k!IiuiUiP.1b>cpcTA.I,o»Hmrwcnx,CrmrtxnJwn*1.rm(jUwknfMc<nt<j(PtrmC讣“中arj1.1.rUj1.kdj<.tniIXaaZ1.e*<hofS<mMDtmgyandCjuUwPI.J<rMofE*pe<nu1.B<<uay.I9KI.211269IOI.MDA吉W果川R：代巴比找酸法.题解Dhinda1.4的方法,为取花生叶片0*.川Sm1.5%J的TCA溶液冰浴屏磨成匀娱,冷冻离心(400.10min).W卜制液2m1.加入2m1.TBA溶液(0.67%),沸水浴50min,冷却后M10离心Iomim分别在450nm、532nm和60Onm处1定吸光值并计算各时期MDA含M,旬处理3个)«乂14叶用RFKttt1.N定祢取相同生长时期的花生叶片“0于装有水，内晌和毒素的战管中.MJK抽气IOmm28C下保畸24h.后用去离子水冲洗分别装入放有5m1.上禺f水的试管中,M压油气IOmin.MU恒湿下挣置2(*.分别于2,4,8,12.24.72.96h测定电导率.用DDS-307型电守车仪在室品卜测定叶片浸出液的电H车.再将各处理材料煮沸I5min冷却至变温后测定城大电导率值.姆处理均十女三次.计尊称素对如用嘤的报伤率.抱仿率(%)=(处理电导率一对JH电导率/(熏沸最火电导率一对H1.电导率×oo1.SDNAIandcrrinu*ttWI户4二人皿KS.MinJY.IXmMBOnu1.irQiJUM1.CIiCuff1.f*cnfdvei1.Jea1.hn11ScknHirvcikmitcrwndiwawJCVkfmYnHJ1.Mo1.11wtMnmInitAKt.*02I<5EW-OI2.DNAUndcrrinf柔用Kim1.Ib衲方法并加以改U.取0国花生叶片以液1.研Ift均匀，加/入DMA提取级冲浪(0.1MSOmMNaCI.IOmMEDTA.2%SDS和1%月住居房气取泗)丁室温中则ffY)min.并与等体枳的Tri"饱和的混仇混化物附心(I(M)OOXg.I5min).上帚液用M仿/异戊醉(24:1,2处理，<.<IO三Xg.I5min)后,用双倍体积的无水乙静沉淀DNA,70%乙邰沈渔，并溶于含HRNawA(40n1.)的TriS-EDTA缓冲液中.在茉前提取和乙坪沉淀府H收DNA.在OJXTr1.boratc-EDTA的1.5%琼脂傩凝股上分离DNA样品.川泱化乙发耍色.并在UVF显色.2佑果与分析Ii次虻U1.mmm分析2.1.1ttMOWWHt(cat)分析梅本接种可使花生叶片中CAT活性明范Ai对空(图I).接种毒我后CAT活性呈现先上升后下注的Q势.在接加4Kh后出现用活性高稣.修依为.为对照的3倍.随后.侑活性立即那低到对照水平，懒活性持械时何短.2J.2过41化帔活性(POD)分析接种毒案后，花生叶片中POD活性隔在3点处理时同增长呈现先上升后卜降的变化均势,且用东接种使花生叶片内POD活性明显高户对照<H2>.PoD活性高峰出现在接种E4Sh,为内阳和水接种的3倍.两后而活性立即降低.2J.3检气化物敦化(SOD)分析Ai或臾种过程中花生叶片的SOD活性明显%于对照(S3h接种毒段后SOD活性拈现先上升后下降的华峰曲线.防活性岛蜂在接种48h后出现.标位为723.3.为内用和水接种的3S倍.版即修活性Pf怔.2.2tt*1.KAtt>M11A含量分析MDAMM寄主怏系统受到破坏的程度即侦族过班化的&要折标,花点茶接种过程中MDA含量分别在I2和72h达到物值.峰催分别为4.3和S3.显著5于对照.内用作为阳性对照时MDAa!送高于水但含此水平处J稳定水平,故HI除嘏米接种中内雨的作用.为水接种的2倍，表明接种叶片前期活性欲含呆的增加,我使叶片发生脂以过辄化.-F=-Ote3M2、5M1.19»"*MBWim生“片SCM>SttMMEnEonSoD“th厕inIcm%c<fpe«nu1.M11crinUt<withIud1.IC*>-t>I*I3244Vt小沁MBHMNW½HMMDMftMK11cc1.gMDA(Mi1.、*ink>e*ofIKanMIAftetimuM1.i<avidhIuua23iS性气分析2.3.11M1.朋