免疫荧光法检测登革病毒 IgG 抗体标准操作程序.docx

免疫英光法检费登革病毒IgG抗体标湛I作程序1目的免疫荧光法（IFA）检测抗登革病毒IgG抗体.2适用范围适用于人血清或血浆中登革热病毒特异性IgG抗体的快速检测。3实验前准备（1）核对被检样品（血清或血浆）忠者的姓名、编号及检测项目等。（2）待测样品在检测前应放置于2-8°C冰箱或置广冰上.5检测项目及套数本方法检测项目为检测血清或血浆中抗登革热病毒IgG抗体6检潴仪器设备和材料6.1 DV1.-4型抗原片：DV标准毒株感染VERO或BHK21细胞制备，低温干燥保存：6.2 对照：登革热患者恢宾期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）：63羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体：6.4 常用稀择液：pH7.27.4PBS、伊文思兰等：6.5荧光显微镜。7检测的环境条件生物安全二级实验室（BS1.-2）中进行.样本灭活后可在生物安全一级实脸室.（BS1.-D内进行。«½½HI:8.1 用pH7.4,（）.（）2n>1.1.PBS稀择待检血清，从1:20开始做2倍连续稀释至需要的稀释度。8.2 取出抗原片，用蒸储水漂洗后，风干。8.3 用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上推为急性期血清，卜排为恢更期血清），在37水浴箱渔盒孵育30分钟（每次试脸同时设阳、阴性对照）1,8.4用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馄水洗涤I次脱盐，风干。8.5 用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀择荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干.8.6 荧光显微镜观察结果。9结果判断I细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应坳区分为17个*+"“可参梯性删敷<25%为M25%YO%为1+-，51%75%为-÷+11.>75%为'+÷+":无特异性荧光界为一”（阴性）。检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应O"+"）最高血清稀释度的倒数表示。10IX阳性结果，表明曾受到登革病博感染，恢笈期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。