关于LacZ DNA 标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用.docx

关于1.aCZDNA标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用【摘要】目的观察1.acZDNA标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用。方法装载1.aCZDNA的腺病毒在小鼠高氧模型开始前2天经鼻腔送入体内，X-gal染色和B-半乳糖酶活性测定用于确定1.acZDNA在肺内转染的分布及其蛋白表达产物的活性;小鼠肺干/湿重比和支气管肺泡盥洗液(BA1.F)内的蛋白浓度的测定用于鉴定腺病毒在基因治疗过程中可能存在的致炎作用。结果X-gal染色显示1.acZDNA在高氧前及后均可广泛转染在肺各级支气管和肺泡上皮细胞，B-半乳糖酶活性的测定提示了1.acZDNA可成功地翻译成其蛋白质表达产物并表现为高表达;同时，腺病毒的致炎作用在高氧吸入48h后示小鼠肺干/湿重比和BA1.F蛋白浓度均较其他对照组明显升高，但其升高的程度可在24h后迅速缓解上升趋势。结论腺病毒为载体的基因治疗可有效地转染标记基因，同时，腺病毒虽在基因治疗的过程中有一定的致炎作用，但是暂时的，其仍是有效的DNA载体。【关键词】腺病毒;基因治疗;1.acZ;高氧性肺损伤;载体AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectsofgenetransferandendogenousinflammationofadenovirusmarkedby1.acZDNAtohyperoxialunginjuryingenetherapy.MethodsAdenovirusencoded1.acZDNAwasintranasaladministeredtomiceat2daysearlierbefore100%02inhalation,X-galstainingandactivitymeasurementof-galproteintranslatedfrom1.acZDNAwereappliedtodeterminethelevelof1.acZDNAtransferandit'sproteinexpression;meanwhile,mouselungwet/dryratioandproteinconcentrationinbronchusalveolarfluidweremeasuredtovaluatethedegreeofinflammationreactionfromadenovirus.ResultsX-galstainingshowed1.acZDNAcouldtransferbroadlyinseriesoflungbronchusandalveolarepithelialcellsnomatterbeforeorafter100%O2inhalation;-galproteinactivitymeasurementpresented1.acZDNAcouldsuccessfullytranslatedintoit'sproteinexpressionwithhighlevelexpression;meanwhile,endogenousinflammationofadenovirusshowedmouselungwet/dryratioandproteinconcentrationinbronchusalveolarfluidweresignificantlyincreasedatthe48hof100%O2inhalationcomparedtocontrolgroups,butlostthepatternofcontinueincreasingafteranthercontinual24hof100%O2inhalation.ConclusionBeingvectorofgenetherapy,adenoviruscouldsuccessfullytransfertargetDNA,while,adenoviruswouldbringsomedegreeofendogenousinflammation,butitistemporarily,itisstillavalidityvectoringenetherapy.Keywordsadenovirus;genetherapy;1.acZ;hyperoxialunginjury;vector基因治疗(genetherapy)是指将外源正常基因通过载体导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。携带基因进入细胞内表达的载体有病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体又分腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒载体等;非病毒载体包括脂质体、磷酸钙、基因枪等。腺病毒是基因治疗的主要载体，并占所有基因治疗研究中的28%1,2。急性肺损伤（A1.I）是严重威胁生命安全的常见急危重症，其病死率在我国高达60%-70%o传统的A1.I治疗方案对挽救生命和疾病转归影响有限3,因此，尝试新的治疗手段如基因治疗已是目前研究的热点。然而，关于腺病毒自身的致炎作用在以其为载体的基因治疗对A1.I治疗效果影响的报道尚少见。本研究在建立小鼠A1.I疾病模型的基础上，观察了腺病毒的转染和致炎作用对小鼠A1.I基因治疗效果的影响及意义。1材料与方法1.1 材料动物：本所研究使用的小鼠均获得美国宾夕法尼亚大学动物部批准。小鼠随机性分为4组：（1）氧气吸入前对照组（COn组）15只;（2）1.aCZDNA标记的腺病毒治疗组（Ad1.aCZ组）20只;磷酸盐缓冲液（PBS）治疗组（PBS组）20只;无治疗组（无治疗组）20只。1.2 方法121经鼻腔通道的治疗方法在100%02暴露前2天，根据小鼠体重将腺病毒浓缩制剂用缓冲剂调整到每只小鼠给药50l,并将总容量分为4次在小鼠麻醉状态下呈垂直位时经鼻腔吸入。1.2.2 高氧性肺损伤模型各组小鼠随机取样后，将他们同时暴露于100%02灌注的氧舱内以制造高氧性肺损伤动物模型。氧舱内氧流量为681.min,舱内氧气交换频率是67次/h,2<0.2%,湿度约45%,并维持约12h的白天黑夜交替。在100%02吸入后的24、48和72h,分别收集肺组织和肺泡灌洗液等标本以备检测之用。1.2.3 标本的收集和处理在高氧吸入前及后的24、48和72h,应用苯巴比妥(50mgkg)腹腔深度麻醉小鼠后，暴露小鼠主气管并行气管插管和机械通气。沿胸腹中线切开皮肤和腹部皮下组织以暴露腹腔脏器和腹主动脉。隔断腹主动脉放血以减少肺部血流量，随后，打开胸腔，分离心脏及肺旁结缔组织，并经右心室穿刺，肺泡灌流液以20-30cmH2O(lcmH20=0.098kPa)水压经右心室灌流肺组织，至肺组织内血液冲洗干净。分离出的肺组织在液氮中快速冷藏，并将肺标本保存在-80国的冰箱内以备用。另外，在机械通气后及肺泡灌流之前,用注射器灌洗肺泡3次，并收集支气管-肺泡灌洗液。灌洗后的肺组织经由主气管灌入4%的甲醛溶液至肺泡内以备用于肺组织的细胞化学染色。1.2.4 X-gal染色B-半乳糖酶(X-gal)染色4可以提供1.acZDNA整合到肺上皮细胞DNA后的蛋白表达分布的影像学分析。新鲜整体肺组织在福尔马林液内固定并彻底漂洗后，在X-gal复合试剂(K4Fe(CN)6-3H2O,K3Fe(CN)6,2mMMgCI2and0.5mgmlofX-gal)内孵育过夜。次日，PBS漂洗后，观察肺组织X-gal颜色后的蓝色深浅程度及范围并摄片记录。染色后的整体肺组织依次通过10%、20%和30%蔗糖溶液再次固定。随后，将肺组织包埋在OCT复合物并在液氮中迅速冷冻成型。沿气管纵轴将肺组织切成厚度为IOum的切片;核红试剂复合染色后，可在荧光显微镜下观察摄片(200倍)。1.2.5 %半乳糖酶活性测定IOmg肺组织在0.25mol1.Tris-HCI的均浆缓冲液中快速匀浆。200l邻硝基酚半乳糖虱反应底物和900l含-筑基乙醇的裂解试剂混匀后加入100l肺组织匀浆并孵育在370至产生O-硝基11比喃(ONP),该产物可在波长42Onm的分光光度仪测定。同时，以牛V球蛋白为标准物测定肺组织均浆内的蛋白浓度，B半乳糖酶的活性表达为单位/毫克蛋白(U/mg)。1.2.6 肺干/湿重比测定小鼠经苯巴比妥腹腔深度麻醉后，暴露气管并行气管插管和机械通气。开胸后，直接留取肺组织，在迅速吸收肺组织外液体后，称重后即纪录为肺湿重，并送入烘干箱内烘干，约72h后，至反复测量肺重量无变化后，记录为肺干重。1.2.7 支气管肺泡盥洗液内蛋白浓度测定小鼠经气管插管收集支气管-肺泡灌洗液，收集到的灌洗液离心后取其上清液用于蛋白浓度测定，方法采用以牛Y球蛋白为标准物的蛋白浓度测定法。1.3 统计学分析数据表达为(x±s)°使用美国SigmaStat统计分析软件用于显著性差异分析，t检验用于两组之间显著性差异统计学分析;One-WayANoVA检验用于多组之间的显著性差异统计学分析。2结果2.1 腺病毒为载体的1.acZDNA在肺内转染的分布及表达活性小鼠在100%O2吸入前2天经鼻腔吸入装载1.acZDNA的腺病毒，并在100%O2吸入开始时，收集标本并应用X-gal染色以了解1.acZ基因在肺内转染的分布;同时，在100%02吸入开始时及后24、48和72h分别收集肺组织以测定1.acZDNA表达蛋白B-半乳糖酶的活性。X-gal染色结果显示1.acZDNA可在整肺和肺各级支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的广泛转染和分布如蓝色颗粒所示（图1A、B）;1.acZDNA的蛋白表达产物B-gal的活性在100%02吸入前即可被测出，同时，在高氧吸入24、48和72h,B-半乳糖酶的蛋白表达活性呈现持续有效的肺内高表达（分别为3.728、4.034、3.688mg）,并且，在高氧吸入后72h,该蛋白活性的表达仍维持为高氧吸入前水平的2倍以上（表l）o表邛-半乳糖酶的活性2.2 腺病毒载体在高氧性肺损伤基因治疗中的致炎作用肺干/湿重比随高氧暴露时间的延长，呈时间-依赖性升高。100%02吸入48h后，Ad1.aCZ组小鼠的肺干/湿重比和无治疗组小鼠相比，差异有显著性;但在继续02吸入24h后，虽然，Ad1.aCZ组的肺干/湿重比仍维持在较高水平，但和其他两对照组相比，差异无显著性（图2）oAd1.acZ组小鼠的支气管-肺泡灌洗液内的蛋白浓度,在高氧吸入的24h和48h,和无治疗组相比，差异有显著性;而在高氧吸入后的72h,各组小鼠的支气管-肺泡灌洗液内的蛋白浓度的数值已基本上维持在相似的水平。3讨论基因治疗是21世纪新兴的分子生物学医学，它是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高新技术。自1989年ROSenberg首次将基因标记导入黑色素瘤病以来，基因治疗作为治疗疾病的一种超前手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。目前基因治疗已广泛地应用于多种遗传性疾病和后天获得性疾病的尝试性的治疗实践中，其中全世界有四种病例已确定有肯定疗效,即：联合免疫缺陷症(ADA)、血友病B、家族性高胆固醇血症和遗传性肺气肿6,7o基因治疗成功的关键是选用理想的基因载体，并通过基因载体独特的基因转染性，将靶基因有效持续地转染到目标细胞DNA内，同时，该基因载体的结构设计还需最大限度地避免载体本身所引发的毒副反应的发生。目前数十种有潜力的基因载体已广泛的应用于基因治疗的动物或临床研究中2,8,其中腺病毒用于基因载体的研究居首位。这不仅是因为腺病毒具有很强的基因转染性，同时还具有其他载体少有的可转染大片段靶DNA的能力。虽然，腺病毒自身的病原毒副反应可引发机体炎症反应，从而限制了基因治疗的成功率，但随着对腺病毒载体结构