CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型肝小叶内卵圆细胞总体积与轮廓数密度变化的体视学分析.docx

肝纤维化及肝硬化DOI:10.12449/JCH240113CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型肝小叶内卵圆细胞总体积与轮廓数密度变化的体视学分析王JII林L刘全明2,杨霞2,杨正伟3,梅小平I,彭彬31川北医学院附属医院感染科，四川南充6370002川北医学院临床医学系,四川南充6370003川北医学院基础医学与法医学研究所，四川南充637000IK言储：蹄,340255492(ORQD:00-0002-6947-2570)摘要：目的定量研究CCL诱导的肝纤维化大鼠肝小叶内卵圆细胞(HoC)总体积和轮廓数密度的变化。方法将11只雄性健康SD大鼠随机分为对照组(。=5)、肝纤维化组(。=6),每周2次皮下注射CQ,与橄榄油混悬液，每次3mlkg.在肝纤维化造模5周后取材，从每只大鼠肝脏随机抽选5个大小约1mnr?的肝组织块分别制作1张EPOn812环氧树脂包埋超薄切片，运用体视学方法结合透射电子显微镜技术，对大鼠肝小叶内的HoC总体积和轮廓数密度进行定量研究，另从每只大鼠剩余肝脏等距随机抽选4个2mm厚的肝组织块并分别制作2张石蜡包埋的Masson染色切片，按照肝纤维化Metavir分期标准定性评估每只大鼠的肝纤维化程度。计量资料两组间比较采用成组，检验。结果体视学定量研究显示，对照组肝小叶内HOC总体积为(15.40±7.63)mm3,肝纤维化组肝小叶内HOC总体积为(146.80±114.00)mm与对照组匕傲，肝纤维化组大鼠肝小叶内HC)C总体积显著增加了8.53倍(f=-2.551,P=O.031);对照组肝小叶内He)C轮廓数密度为(56.20±40.40),肝纤维化组肝小叶内Hc)C轮廓数密度为(566.50±317.00),与对照组比较，肝纤维化组大鼠肝小叶内轮廓数密度显著增加了9.08倍(t=-3.539,P=O.006):定性嫄研究结果显示，肝纤维化大鼠肝纤维化分期按照MetaVir评分标准达11I11期，大鼠案周隙内肝星状细胞增生部位周围伴随着HOC的大量增生。结论Cd4诱导肝纤维化大鼠肝小叶内Hc)C显著增生。关键词：肝纤维化；大鼠,Sprague-Dawley;肝卵圆细胞；肝星状细胞基金项目：川北医学院2021年度校级科研发展计划项目(CBY21-QA14)；南充市2020年市校科技战略合作专项(20SXQT0304)Changesinthetotalvolumeandcontourdensityofovalcellsinhepaticlobulesofratswithcarbontetrachloride-inducedhepaticfibrosis:AStereologicalstudyWANGChuanlin1,LIUQuanminc,YANGXi,YANGZhengweP,MEIXiaoping1,PENGBirr,.(1.DepartmentofInfectiousDiseases,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;2.DepartmentofClinicalMedicine,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;3.InstituteofBasicMedicineandForensicMedicine,NorthSichuanMedicalCollegelNanchong,Sichuan637000,China)Correspondingauthor:PENGBin,340255492(ORCID:0000-0002-6947-2570)Abstract:ObjectiveToquantitativelyinvestigatethechangesinthetotalvolumeandcontourdensityofhepaticovalcells(HOC)inhepaticlobulesofratswithcarbontetrachloride(CCI4)-inducedhepaticfibrosis.MethodsAtotalof11healthymaleSprague-Dawieyratswererandomlydividedintocontrolgroupwith5ratsandhepaticfibrosisgroupwith6rats,andCaanddiveoilsuspensionwereinjectedsubcutaneouslytwiceaweek,3mLkgeachtime.Afterfiveweeksofhepaticfibrosismodeling,fivelivertissueblockswithasizeofabout1mm3wererandomlyselectedfromtheliverofeachrattoprepareoneEpon812epoxyresin-embeddedultrathinsection,andtheStereologicalmethodandtransmissionelectronmioscopywereusedforthequantitativeanalysisofthetotalvolumeandcontrdensityofHOCinthehepaticlobulesofrats.Inaddition,fourlivertissueblockswithathicknessof2mmwererandomlyselectedfromtheremainingliverofeachrattopreparetwoparaffirvembeddedMassonstainingsections,andthedegreeofliverfibrosisineachratwasqualitativelyevaluatedaccordingtotheMetavirstagingcriteriaforliverfibrosis.Theindependent-samplesttestwasusedforcomparisonofcontinuousdatabetweengroups.ResultsThequantitativeStereologicalanalysisshowedthatthetotalvolumeofHOCinhepaticlobuleswas15.40±7.63mm3intheControlgroupand146B0±114.00mm3intheliverfibrosisgroup,andcomparedwiththecontrolgroup,thetotalvolumeofHOCinhepaticlobulesofratsintheliverfibrosisgroupwassignificantlyincreasedby8.53times(t=-2551,P=Q031);thecontourdensityofHOCinhepaticlobuleswas5620±40.40inthecontrolgroupand56650±317.00intheliverfibrosisgroup,andcomparedwiththecontrolgroup,thecontourdensityofHOCinhepaticlobulesofratsintheliverfibrosisgroupwassignificantlyineasedby9.08times(V-3539,P=0.006).Qualitativeobservationshowedthatliverfibrosisstageofratsreachedstage11-IHaccordingtotheMetavirscoringcriteria,andmassiveproliferationofHOCwasobservedaroundtheproliferationsiteofhepaticstellatecellsintheperisinusoidalspaceofrats.ConclusionCCI4inducessignificantproliferationofHOCinhepaticlobulesofratswithliverfibrosis.Keywords:HepaticFibrosis;Rats,Sprague-Davdey;HepaticOvalCells;HepaticStellateCellsResearchfunding:NorthSichuanMedicalCollege2021Schl-LevelScientificResearchDevelopmentPlanProject(CBY21-QA14);NanchongSpecialProjectforMunicipalandUniversityScienceandTechnologyStrategicCooperationin2020(20SXQT0304)肝纤维化和终末期肝硬化是严重的全球医疗问题，的方法电镜下HOC形态学特征为胞体近似圆形或卵但肝纤维化发生机制目前仍未完全阐释清楚。肝星状细胞（HSC）活化被认为是肝纤维化的关键环节fl31本课题组前期采用体视学方法结合电镜技术研究了CCI4所致肝纤维化大鼠肝组织超微结构的改变，发现肝纤维化大鼠夏周隙内HSC数量显著增加si。同时，还在大鼠肝小叶内（主要是卖周隙以及肝细胞间）观察到了大量增生的幼稚细胞。通过直阅文献，根据这种幼稚细胞电镜下的形态学特征、位置，判断这种幼稚细胞可能是肝脏干细胞中的卵圆细胞（hepaticovalcell,HOC）%）.HOC是一类具有多向分化潜能的肝脏干细胞，研究表明，HOC也参与了肝纤维化的过程，但是HOC在肝纤维化过程中所起的作用目前尚存争议.有研究（71报道，HOC在HSC活化过程中通过合成结缔组织生长因子，促进HSC的增殖和细胞外基质（ECM）的分泌，加重肝纤维化但也有研究【8】发现体外诱导人胚胎干细胞分化为HOC,将其移植入CCI4诱导的肝纤维化大鼠体内，能有效减轻肝纤维化。HOC在CCI4诱导的肝纤维化大鼠模型中扮演什么样的角色，究竟是加重肝纤维化还是改善肝纤维化，值得进一步思考。由于HOC在正常肝脏中数量极少，仅占正常肝细胞的1%3%,且HOC体积很小，光镜下很难被辨认。另外目前HOC的表面标志物如胆管上皮角蛋白CK7、CK8、CKI8、CKI9、OV6、c-metHE/V125和HepPariW乏特异性，不同亚群及不同发育阶段的HOC所表达的标志物也不尽相同，HOC的分子鉴定研究也存在一定困难1"°）.因此电镜研究HoC被认为是最可靠和最有价值圆形，胞核大，胞浆相对较少，核质匕嘀，核仁明显，胞质内细胞器较少，含少量粗面内质网与缔体l5-6为明确CCL1诱导的肝纤维化大鼠是否伴有肝小叶内HOC总体积与轮廓数密度的变化，进一步探讨HOC在肝纤维化进程中的作用，本课题组采用体视学方法结合透射电镜技术测量了CCL1诱导的肝纤维化大鼠肝小叶内HOC的总体积与轮廓数密度，以期为HOC在肝纤维化中的作用提供形态定量证据。1材料与方法1.1实验动物与分组11只3月龄健康雄性SD大鼠r体质量160180g,购买于川北医学院动物实验中心，SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为2组：对照组（/7=5）、肝纤隹化组（"=6）.1.2动物模型建立1.2.1肝纤维化组模型制备将橄榄油（国药集团化学试剂有限公司）与CCI4（国药集团化学试剂有限公司）按体积比2:3配成40%橄榄油与CCI4混悬液，在大鼠背部皮下注射3mLkg的橄憎由与CQ.混悬液，每周注射2次，建立大鼠肝纤维化模型