蜡样芽胞杆菌检测.ppt.ppt

蜡样芽胞杆菌检测Bacillus cereus examination 芽胞杆菌属（芽胞杆菌属（BacillusBacillus）在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多食品中常见水中，植物和许多食品中常见 已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、酱油、布丁、米饭及各种甜点。蔬菜、鱼、酱油、布丁、米饭及各种甜点。19501950年首次在挪威明确报告其致病作用。年首次在挪威明确报告其致病作用。在国内，于在国内，于19731973年首次报告了南京某托儿年首次报告了南京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕吐型蜡样芽胞杆菌食所儿童因进食泡饭引起呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒后，至今除西藏外，每个省、自治区、物中毒后，至今除西藏外，每个省、自治区、直辖市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食直辖市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食物中毒的首位。物中毒的首位。以夏季（以夏季（6-106-10月）为主月）为主 致病因子为细菌繁殖过程中产生的细菌毒素致病因子为细菌繁殖过程中产生的细菌毒素 中毒食品含菌量在中毒食品含菌量在106CFU/g(ml)106CFU/g(ml)以上以上 引起中毒的原因常为食品食前保存温度不当，引起中毒的原因常为食品食前保存温度不当，放置时间较长或食品加热不当放置时间较长或食品加热不当 美国美国 炒米饭炒米饭 欧洲欧洲 甜点、肉饼、色拉、奶和肉制品甜点、肉饼、色拉、奶和肉制品 中国中国 米饭、淀粉类制品米饭、淀粉类制品“腹泻型腹泻型”：潜伏期为：潜伏期为8h8h16h16h，主要，主要症状为症状为水泻、腹痛、腹痉挛为主，病程约水泻、腹痛、腹痉挛为主，病程约24h24h。“呕吐型呕吐型”：潜伏期为：潜伏期为0.5h0.5h5h5h，症状以恶心、，症状以恶心、呕吐为主，病程不超过呕吐为主，病程不超过24h24h。腹泻毒素：为大分子量蛋白质，引发腹泻型综腹泻毒素：为大分子量蛋白质，引发腹泻型综合症合症,能在各种食物中形成能在各种食物中形成;呕吐毒素：为小分子量、热稳定多肽，呕吐毒素：为小分子量、热稳定多肽，100100 30min30min不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中形成。因素，常在米饭中形成。背景现行标准不足处重新修订的意义 第一版标准：第一版标准：食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验 蜡样蜡样芽胞杆菌检验芽胞杆菌检验（GB/T 4789.14-1984GB/T 4789.14-1984）该标准的颁布为蜡样芽胞杆菌的规范检测，为该标准的颁布为蜡样芽胞杆菌的规范检测，为蜡样芽胞杆菌病的监测、预防、控制起到了重蜡样芽胞杆菌病的监测、预防、控制起到了重要的作用。要的作用。在以后的二十年时间里，食品中蜡样芽胞在以后的二十年时间里，食品中蜡样芽胞杆菌检测标准经过杆菌检测标准经过19941994年、年、20032003年二次修订，年二次修订，但内容可以说完全与但内容可以说完全与19841984年版相同。年版相同。1.1.对蜡样芽胞杆菌含量少于对蜡样芽胞杆菌含量少于1000cfu/g1000cfu/g的样品的样品计数效果差。计数效果差。2.2.采用的采用的363611培养温度并非是蜡样芽胞培养温度并非是蜡样芽胞杆菌最适生长条件。杆菌最适生长条件。3.3.检验结果与现行的其它国家的标准存在一定检验结果与现行的其它国家的标准存在一定差异差异。重新修订的意义提高检提高检出率出率扩大检扩大检测范围测范围与国际与国际接轨接轨适用性适用性和可操和可操作性作性 蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为30303232。经标准修订协作组验证：经标准修订协作组验证：蜡样芽胞杆菌在蜡样芽胞杆菌在MYPMYP培养基的培养条件以培养基的培养条件以 30 30 1 1 培养培养48h48h的生长率最高，平均生的生长率最高，平均生长率达到了长率达到了93.69%93.69%。其次为。其次为30 30 1 1 培养培养24 h24 h，平均生长率为，平均生长率为92.28%92.28%。生长率最低的培养条件为生长率最低的培养条件为36 36 1 1 培培养养24 h24 h。平均生长率为。平均生长率为82.32%82.32%。经统计学分析，经统计学分析，30 30 1 1 培养温度的培养温度的生长率显著高于生长率显著高于36 36 1 (P1 (P0.050.05），但在培养温度相同的情况下，），但在培养温度相同的情况下，培育时间培育时间24h24h和和48h48h蜡样芽胞杆菌生长率蜡样芽胞杆菌生长率无显著差异（无显著差异（P P0.050.05）。）。比对单位菌量（cfu/皿）MYP平板计数结果30 1 24h30 1 48h36 1 24h36 1 48h计数结果cfu/皿生长率（%）计数结果cfu/皿生长率（%）计数结果cfu/皿生长率（%）计数结果cfu/皿生长率（%）吉林省CDC8688102.3388102.336474.426474.42湖北省CDC4048120.0048120.0045112.5045112.50江苏省CDC672537.312638.815074.635074.63浙江省CDC17073104.2873104.286491.436491.43广东微生物研究所5981137.2988149.1561103.3871120.34浙江省CDC2916571.425964.845964.845054.95浙江省CDC33437108.8237108.822573.532573.53平均值63.8659.5792.2859.8693.6952.5782.3252.7182.54 增加了增加了MPNMPN法法 以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于10103 3 cfu/mLcfu/mL时用平板计数法计数不准的问题时用平板计数法计数不准的问题 美国美国FDAFDA、ISOISO、以及、以及SN 0176-92SN 0176-92标准除采用平标准除采用平板计数外，还采用了板计数外，还采用了MPNMPN法法 该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易推广使用。推广使用。增加了根状生长试验和溶菌酶试验。增加了根状生长试验和溶菌酶试验。描述具体化描述具体化,提高方法的可操作性提高方法的可操作性 样品处理和制备等与其它标准匹配，提样品处理和制备等与其它标准匹配，提高方法的适用性高方法的适用性 考虑我国的实际情况，保持与原标准的考虑我国的实际情况，保持与原标准的连续性连续性 修改了标准名称；修改了标准名称；增加了增加了“第二法第二法 蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌MPN MPN 计数法计数法”；将选择性分离培养基（将选择性分离培养基（MYPMYP）培养条件由）培养条件由37 37 培培养养12 h-20 h12 h-20 h改为改为30 30 1 1 培养培养24 h-48 h24 h-48 h；增加了根状生长试验和溶菌酶试验；增加了根状生长试验和溶菌酶试验；增加了典型菌落计数和确认；增加了典型菌落计数和确认；增加了附录增加了附录A A、附录、附录B B。标准修订单位标准修订单位 浙江省疾病预防控制中心浙江省疾病预防控制中心 国家食品安全评估中心国家食品安全评估中心 吉林省疾病预防控制中心吉林省疾病预防控制中心 江苏省疾病预防控制中心江苏省疾病预防控制中心 广东微生物研究所广东微生物研究所 本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检验方法。本标准适用于各类食品及食物中毒样品中的蜡样芽胞杆菌检验2.1 冰箱：2-5。2.2 恒温培养箱：30 1、36 1。2.3 均质器。2.4 电子天平：感量0.1 g。2.5 无菌锥形瓶：100 mL、500 mL。2.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。2.7 无菌平皿：直径90 mm。2.8 无菌试管：16 mm160 mm。2.9 显微镜：10-100。3.1 3.1 磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBSPBS）3.2 3.2 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)(MYP)3.3 3.3 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤胰酪胨大豆多粘菌素肉汤 3.4 3.4 营养琼脂营养琼脂 3.5 3.5 胰酪胨大豆羊血琼脂胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)(TSSB)3.6 3.6 溶菌酶营养肉汤溶菌酶营养肉汤第一法第一法 蜡样芽胞杆菌平板计数法蜡样芽胞杆菌平板计数法 冷冻样品应在冷冻样品应在4545以下不超过以下不超过15 min15 min或或在在2288不超过不超过18 h18 h解冻。若不能及解冻。若不能及时检验，应放于时检验，应放于-15-15左右保存；左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应置于若不能及时检验，应置于2288冰箱冰箱保存，在保存，在24 h24 h内检验。内检验。以无菌操作取样品以无菌操作取样品25 g25 g（mLmL），加入），加入PBS 225 PBS 225 mLmL，用旋转刀片式均质器以，用旋转刀片式均质器以8000 r/min8000 r/min10000 r/min10000 r/min均质均质1 min1 min2 min2 min，或拍击式均，或拍击式均质器拍击质器拍击2 min2 min。如无均质器，则将样品放入。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后称取无菌乳钵中磨碎，然后称取25 g25 g（mLmL）置合适）置合适的容器中，加的容器中，加225 225 mLmL PBS PBS，充分振荡混匀。制，充分振荡混匀。制成成1:101:10的样品匀液。的样品匀液。样样品的稀释品的稀释 吸取上述吸取上述1:101:10的样品匀液的样品匀液1 1 mLmL加到装有加到装有9 9 mLmL PBSPBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1:1001:100的样品匀液。的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 1次，换用次，换用1 1支支1mL1mL无菌吸管或吸头。无菌吸管或吸头。5.45.4样品接种样品接种 根据对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择2 2个个 3 3个个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以液），以0.3 0.3 mLmL、0.3 0.3 mLmL、0.4 0.4 mLmL 接种量分接种量分别入三块别入三块MYPMYP琼脂平板，然后用无菌琼脂平板，然后用无菌L L棒涂布整棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如使用前，如MYPMYP琼脂平板表面有水珠，可放在琼脂平板表面有水珠，可放在25 25 50 50 的培养箱里干燥，直到平板表的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。面的水珠消失。5.55.5分离、培养分离、培养 5.5.1 5.5.1 分离分离 在通常情况下，涂布后，将平板静置在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30 30 1 1 培养培养1 h1 h，等样品匀液吸收后翻转平，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，皿，倒置于培养箱，30 30 1 1 培养培养24 h24 h2 2 h h。如果菌落不典型，可继续培养如果菌落不典型，可继续培养24 h24 h2 h2 h再观再观察。察。在在MYPMYP琼脂平板琼脂平板上，典型菌落为微上，典型菌落为微粉红色粉红色(表示不发酵表示不发酵甘露醇甘露醇)，周围有白，周围有白色至淡粉红色沉淀色至淡粉红色沉