电化学发光免疫分析法.ppt

电化学发光免疫分析法Electro-Chemiluminescence Immunoassay(ECLI)1w免疫分析法w发光和化学发光w化学发光免疫分析法w电化学发光w电化学发光免疫分析法2免疫分析w 基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段；w 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。3免疫学检测历史演进w 放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院）；w 酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）；w 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。4w免疫分析法w发光和化学发光w化学发光免疫分析法w电化学发光w电化学发光免疫分析法5发光现象6萤火虫发光7深海鱼发光8发光分类w 光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。w生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。w化学发光9化学发光化学发光Chemiluminescence(CL)w 化学发光是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。10 化学发光反应包括两个关键步骤，即化学激发和发光。化学发光反应能级图11化学发光分析w 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，称为化学发光分析。12化学发光分析优点w 化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度，w 并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。13化学发光分析缺点w 虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。14w免疫分析法w发光和化学发光w化学发光免疫分析法w电化学发光w电化学发光免疫分析法15化学发光免疫分析chemiluminescence immunoassay（CLIA）w CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。w 这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。16化学发光免疫分析（CLIA）分类w 按分离方法不同分n微粒子化学发光免疫测定n磁颗粒化学发光免疫测定17化学发光免疫分析（CLIA）分类w 按发光剂不同分为n发光酶免疫测定（chemiluminescence enzyme immunoasssay，CLEIA）n化学发光免疫测定技术（chemiluminescence immunoassay，CLIA）n电化学发光免疫测定技术（electrochemiluminescence immunoassay，ECLI）18w免疫分析法w发光和化学发光w化学发光免疫分析法w电化学发光w电化学发光免疫分析法19电致化学发光（ECL)w 电致化学发光(ECL)是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。20电致化学发光（ECL)w ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活性。21电化学发光剂w 定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。w 特点n反应在电极进行n化学发光剂：三联毗啶钌n电子供体为：三丙胺（TPA）22三联毗啶钌分子结构图NNNNNNRuOONOO23三联吡啶钌（Ru(bpy)32+）特点w ECL分析中采用Ru(bpy)32+作为标记物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羟基琥珀酸胺酯（NHS），该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。24三联吡啶钌（Ru(bpy)32+）特点w Ru(bpy)32+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性；w Ru(bpy)32+分子量小，空间位阻小，即便小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大大丰富，更重要的是为其检测菜单的开发前景提供了广阔空间。25电化学发光原理图TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光 子(620nm)333*基态激发态不稳定26w免疫分析法w发光和化学发光w化学发光免疫分析法w电化学发光w电化学发光免疫分析法27电化学发光免疫分析(Electro-Chemiluminescence Immunoassay,ECLI)w ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一代标记免疫测定技术；w ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物；w ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。28ECLI原理w 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。29ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）30ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）31ECLIA体系结构图32ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）33ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）34ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）35方法评价w 采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大2030倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快；36方法评价w“链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高；37方法评价w 利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化；w 标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。38ELIA优越性w 高度敏感，可达pgml或pmol水平；w 特异性强，重复性好，CV5。w 测定范围宽，可达7个数量级。w 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。w 操作简单，耗时短，易于自动化。w 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。39临床应用w 激素w 肿瘤标记物w 内分泌功能w 传染性疾病w 其它n如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。40