TGXAS-海洋沉积物类固醇激素的测定的测定高效液相色谱-串联质谱法.docx

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1、ICS71.040.40CCSZ10T/GXAS体标准TGXASXXXXXXXX海洋沉积物类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法MarineSedimentDeterminationofsteroidhormonesSolidphaseextraction-HighperformanceIiquidchromatographymassSpectrometricmethod（征求意见稿）XXXX- XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施广西标准化协会发布目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14方法原理15干扰和消除16试剂和材料17仪器和设备28样品29分析步骤310结果计算及

2、表示511精密度和准确度812质量保证和质量控制813固体废物处置9附录A（规范性）方法检出限和测定下限10附录B（规范性）精密度和正确度1三,/1刖百本文件参照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西环境科学学会提出、归口并宣贯。本文件起草单位：广西壮族自治区海洋环境监测中心站、广西壮族自治区北海生态环境监测中心、上海第二工业大学、广东海洋大学、广西壮族自治区钦州生态环境监测中心、广西蓝合创讯数据科技有限公司。本文件主要起草人：任朝兴、蓝文陆、韦业、龙慧琴、王其

3、春、高桂兰、房琴、苏子幸、吴鑫、张文武、王永峰、贺亮、王晓旭、宋宝、邓元秋、黄仕英、赵利容、张鹏、张际标、彭梦微、吴茂银。海洋沉积物类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法警示：实验中使用的溶剂和试剂均具有一定的毒性，对健康具有潜在的危害，应尽量避免与这些化学品直接接触。试剂配制和样品前处理过程应在通风橱内进行，操作时应按要求佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。1范围本文件规定了测定海洋沉积物中类固醇激素的高效液相色谱-串联质谱法。本文件适用于海洋生物体中的雄激素（诺龙、表睾酮、甲睾酮、雄烯二酮）、孕激素（孕酮、快诺酮、甲羟孕酮、甲地孕酮）、糖皮质激素（可的松、氧化可的松、地塞米松）和雌激素（雌

4、酮、17-雌二醇、17B-雌二醇、雌三醇）等15种类固醇激素的测定，其他类固醇激素经适用性验证可参照执行。当样品量为5.OOg,浓缩后定容体积为LomL,进样体积为5.0PL时，方法检出限为0.1PgAg-0.9Hg/kg,测定下限为0.4gkg3.6gkg,详见附录A。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB17378.3海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输GB17378.5海洋监测规范第5部分：沉积物分析UJ442.4近岸海域环境监测技术规范第四部

5、分近岸海域沉积物监测3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法原理采用超声波提取技术对海洋沉积物进行前处理，用高效液相色谱一三重四极杆串联质谱仪（LC-MS/MS）检测样品中的类固醉激素化合物，按多反应监测（MRM）方式，根据保留时间和特征离子定性，内标法定量。5干扰和消除当样品中存在基质干扰时，可通过优化色谱条件、稀释样品、减少进样体积以及对样品进行预处理等方式降低或消除。当样品中存在同分异构体干扰测定时，可通过改变色谱条件提高分离度或选择不同的二级质谱子离子消除干扰。6试剂和材料A1实验用水，GB/T6682,一级。65乙酸乙酯（CHaCOOCH2CIh）,色谱纯。A1甲醇（CH3

6、。H）,色谱纯。A4氨水（NH3H2）,优级纯。6弓乙酸乙酯/甲醇混合溶液：1：1（体积比）。AA甲酸（HCOOH）：P（HCOOH）=1.22gmL,优级纯。A7甲酸溶液：1：1000（体积比）。取1mL甲酸（6.6）加入IOoomL水中。AR无水硫酸钠：颗粒状，优级纯。或使用无水硫酸钠SPE小柱（2g,6mL）。在400C灼烧4h以上，冷却后转移至玻璃瓶中，密闭保存于干燥器中。6类固醇激素标准贮备液：P=100mg/L。可直接购买有证标准溶液，也可用固体标准物质制备。用甲醇（6.3）溶解并稀释至100mg/L（参考浓度）。贮备液在-20C以下避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室

7、温，并摇匀。AM类固醇激素标准使用液：Q=LOmg/L。将类固醇激素标准贮备液（6.9）用甲醇（6.3）稀释至1.0mg/L（参考浓度）。现配现用。A11内标储备液：P=100mg/Lo采用睾酮-ch、孕酮-cU、氢化可的松T,2-dz、雌三醇-d3内标参照。应采用有证标准溶液或标准物质制备内标储备液，用甲醇（6.3）溶解并稀释至100mg/L（参考浓度）。在-20C以下避光保存或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温，并摇匀。615内标使用液：0=LonIg/L。将内标储备液（6.11）用甲醉（6.3）稀释至LonlgL（参考浓度）。现配现用。611针式过滤器：滤膜为0.22m尼龙或聚四氟

8、乙烯材质。AU滤膜：0.7Mm玻璃纤维滤膜，或相当者。6 11i氮气：纯度299.999队6.16石英砂：粒径50目20目。使用前须检验，确认无干扰。7仪器和设备7 1采样瓶：旋盖广口棕色玻璃瓶，瓶盖具聚四氨乙烯内垫。7）液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源（ESI）,具备流动相梯度洗脱和质谱多反应监测功能。71色谱柱：Gs反相高效液相色谱柱。1.7mX50mm2.1mm（内径）或其他等效色谱柱。74固相萃取装置：自动或手动，流速可调节。74固相萃取柱:HLB柱,填料为二乙烯苯和N-乙烯基毗咯烷酮共聚物或等效柱,规格为6mL/200mg07A浓缩装置：旋转蒸发装置或K-D浓缩器、氮吹浓缩仪等

9、性能相当的设备。71微量注射器或移液枪：10Lx100MLx1mLK5mLo7A分析天平：感量0.01g和0.0001go7Q超声波提取仪：功率不小于5005超声波输出功率可调节。71C低温离心机：2000r或以上。711聚丙烯离心管，旋盖具聚四氨乙烯内垫：50mLo715冷冻干燥仪。711涡旋混匀器。714一般实验室常用仪器和设备。8样品A1样品采集与保存8.1.1按照GB17378.3和HJ442.4中的相关规定进行沉积物样品的采集和保存。R3试样制备8.2.1冷冻干燥除去样品中的石子、贝壳、玻璃等异物，取适量样品进行在冷冻干燥仪（7.12）上进行冷冻干燥。冷冻干燥后的样品一部分用于测定含

10、水率，一部分用于前处理。8.2.2含水率的测定沉积物样品含水率的测定按照GB17378.5执行。8.2.3萃取称取冷冻干燥后的样品约5.0g（精确到0.0001g）,置于50ml离心管（7.11）中，准确加入10ml乙酸乙酯/甲醇（6.5）、2g无水硫酸钠（6.8）,在旋涡混匀器（7.13）上混匀Imin后,置于超声波提取仪（7.9）上超声20min,置于低温离心机（7.10）,以5000r/min速度离心5min,收集上清液。用浓缩装置（7.6）浓缩至1mLo8. 2.4净化分别用IOmL乙酸乙酯/甲醇混合液（6.5）、甲醇（6.3）和实验用水以InILmin流速活化固相萃取柱（7.5）o在

11、上述浓缩液中加入20OmL纯水，混匀，水样以约IomLIin的流速通过固相萃取柱（7.5）。再用IOnlL水淋洗，去除杂质，用氮气（6.15）吹干固相萃取柱（7.5）。用K）mL乙酸乙酯/甲醇混合溶液（6.5）以ImLmin流速洗脱富集后的小柱，收集洗脱液。用浓缩装置（7.6）将上述洗脱液浓缩至LOmL以下，用甲醇（6.3）定容至LOmL,加入50HL内标物使用液（6.12）,使用涡旋混匀器（7.13）混匀后用针式过滤器过滤（6.13）,置于棕色进样瓶中，待测。fi1空白试样的制备以石英砂（6.16）代替样品，按照与试样的制备（8.2）相同操作步骤，进行实验室空白试样的制备。9分析步骤G1仪器

12、调试8.1.1 液相色谱条件9.1.1.1流动相：流动相A甲酸溶液（6.7）,流动相B甲醇（6.3）,梯度洗脱程序见表1和表2；9.1.1.2流速：0.2mL/min；9. 1.1.3柱温：40；9. 1.1.4进样体积：5.0Lo8.1.2 质谱条件9. 1.2.1电喷雾离子源（ESI）,雌激素采用负离子模式，雄激素、孕激素、糖皮质激素采用正离子模式；10. .2.2毛细管电压：4.0kV；11. 1.2.3干燥气温度：350；12. 1.2.4干燥气流速：11L/min；13. .2.5雾化气气压：1.72IO5Pa（25psi）。14. 1.2.6多离子反应监测方式（MRM）,具体条件见

13、表3。表1液相色谱流动相梯度洗脱程序（雄激素、孕激素和糖皮质激素）时间(min)流动相A（%）流动相B（%）095100.595107.559511.059511.195512.5955表2液相色谱流动相梯度洗脱程序（雌激素）时间(min)流动相A（%）流动相B（%）090101901034555表2液相色谱流动相梯度洗脱程序(雌激素)(续)时间(min)流动相A(%)流动相B(%)445558307095951059510.190101：!9010表3目标化合物的多离子反应监测条件化合物名称母离子m/z子离子m/z驻留时间S锥孔电压V碰撞能eV雄激素诺龙(Nondrolone)275.210

14、9.1*4.723525257.33510雄烯一酮(Androstensdione)287.396.84.754024108.9*4023表睾酮(Epitestosterone)289.496.9*5.303525108.93527睾酮-DS(Testosterone-D3)292.397.0*4.923020109.03025甲睾酮(17-Methyltestosterone)303.297.25.203323109.2*3323孕激素快诺酮(Norethindrone)299.2109.1*4.793827231.13820孕酮(Progesterone)315.297.1*5.612823297.12816孕酮-Dg(Progesterone-D9)324.4100.2*5.582820113.12820甲地孕酮(Megetrol)343.397.0*5.282525224.02525甲羟孕酮(Medroxyprogesterone)345.297.1*5.452626123.22624糖皮质激素可的松(Cortisone)359.21