miR-26aSNPrs7372209多态性与无精症的相关性研究.docx

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1、miR-26aSNPrs7372209多态性与无精症的相关性研究目录中文题目、摘要、关键词1英文题目、摘要、关键词21前言32材料和方法33结果44讨论75结论7参考文献8总结与体会9致谢11附录12miR-26aSNPrs7372209多态性与无精症的相关性研究摘要目的：初步探究miR-26aSNPrs73722O9与无精症的相关关系。方法：利用PCR-RFLP技术，在308名(正常生育男性210名，无精症患者98名)男性中，进行miR-26aSNPrs7372209的基因频率和基因型频率的分布调查C结果:与正常对照组相比，患病实验组T等位基因频率(C=,P=),以及纯合子TT基因型频率(2

2、=,p=)和杂合子TC基因型频率降低Y=,P=),纯合子CC基因型频率升高(2=,P=),但差异不显著(P0.05)O结论：miR-26aSNPrs7372209的多态性分布可能与无精症不相关。关键词miR-26a基因；单核甘酸多态性；无精症；男性不育AssociationbetweenPolymorphismsofSNPrs7372209inmiR-26aGeneandazoospermiaAbstractObjective:ThecorrelationbetweenSingleNucleotidePolymorphism(SNP)rs7372209ofmiR-26ageneandazoos

3、permiawaspreliminarilyinvestigated.Methods:ThegeneandgenotypefrequenciesofSNPrs7372209wereinvestigatedin90patientswithazoospermiaand225normalreproductivemenascontrolsbypolymorasechainreactionandpolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthplyphismanalysis(PCR-PFLP).Results:Comparedwiththenormalg

4、roup,thefrequencyofTallele(2=2.141,P=0.143),homozygousTTgenotype(2=0.796,P=0.372)aswellasheterozygousTCgenotype(2=0.034,P=0.854)slightlydecreaseded,thefrequencyofhomozygousCCgenotype(2=2.212,P=0.137)slightlyincreasedinazoospermiagroup,buttheirdifferenceswerenotsignificant(P0.05).Conclusion:Thepolymo

5、rphismdistributionofmiR-26aSNPrs7372209maybeunrelatedtoazoospermia.KeywordsmiR-26agene;singlenucleotidepolymorphism;azoospermia;maleinfertility1前言近些年来，社会发展迅速、环境污染日益严重、人们的生活压力不断增大，不孕症患者的发病率也不断的上升。1在中国，不孕症的发病率大约约是10%,其中男性不育症占到了30%40%,不孕症已成为一个全球性的健康问题。男性不育症的发病机制较为复杂，可为先天性或继发性泌尿生殖系统异常、精索静脉曲张、内分泌失调、性腺感染、

6、线粒体功能障碍或遗传因素，如特发性不育症,约占患者的40%,患者除精子异常外，其他均可显示正常的检查结果3。根据其异常情况，可分为弱精子症、畸形、少精子症和无精子症。15%20%的男性是由无精子症引起的，所以在众多精子异常中，导致不孕的最严重原因是无精子症。4,5omiRNAs(小分子RNA)是近几年来分子生物学研究的热点问题，miRNAs是一种单链非编码小RNA,长度约为19-25个核甘酸。研究结果表明，miRNAs不仅能够参与调控细胞增殖、分化、凋亡等一些生理过程7-8,而且它是精子发生所必需的物质，在精子发生中起着非常重要的作用。因此，miRNA在男性精子发生障碍的病因学中有着很重要的研

7、究价值。miRNA相关的单核甘酸多态性(miRNA-SNP)包括位于miRNA结合位点、miRNA编码基因和miRNA加工基因的单核甘酸多态性。miRNA-SNP的功能有两种机制：功能丧失机制和功能获得机制。研究表明，SNP位点可以通过影响miRNA引起疾病的发生和发展，与疾病或复杂性状相关的SNP位点数量众多，这些SNP位点的具体功能还需要进一步分析和研究，因此研究与miRNA相关的SNP位点具有重要意义。近几年，miRNA在男性不育中的研究越来越深入，一些miRNA被证实与精子发生有关，例如，MiCrORNA-34bc的表达与精子发生密切相关然而，大多数miRNA与生精障碍之间存在的关系需

8、要进一步去研究。MiR-26a在人类3号染色体上，参与着细胞凋亡和增殖过程，总长度为21个核苜酸UL它的表达是非特异性的，在各种组织中广泛表达。12很多研究结果表明，miR26a可以抑制肝癌、乳腺癌和鼻咽癌细胞的增殖13,14。然而，miR-26a与精子发生障碍的关系目前仍不清楚。有鉴于此，本次研究采用基因多态性检测技术研究正常男性和无精子症患者miR-26aSNPrs7372209的基因频率和基因型频率，并初步分析研究了mir-26aSNPrs7372209与男性精子发生障碍的关系。2材料和方法2.1 研究对象本研究患病实验组为90例来自附属医院收集的年龄在2540岁的无精症患者。患者离体的

9、精液经离心沉淀之后，连续3次或3次以上显微镜检无精子。实验对照组为已通过正常途径育有一子的210例年龄在2540岁的正常生育男性。2.2实验试剂（详见附录1）2.3 实验仪器和设备（详见附录2）2.4 方法2.4.1 DNA提取利用加入了200L抗凝剂的血液按DNA提取试剂盒（离心柱形）操作流程进行DNA提取，并放置Oc冰箱保存。2.4.2 PCR扩增通过查询NCBI数据库获得miR-26a基因rs7372209位点两侧的序列，由Primer5.0软件设计PCR扩增的引物。其中引物序列为5,-GCCATCACAGAGCCAaaacg-3,5,-Aggccagtcatgcttacagtcacgt

10、ggttc-3x,PCR扩增片段大小为367bp0.05),无统计学意义(详见表1)。M 123Hardy-Weinerg平衡分析显示，miR-26aSNPrs7372209的基因型分布均符合Hardy-Weinerg平衡(P0.05)。367bp228bp139bp注：M：DNA分子量标记；1：基因型TT；2：基因型CC；3：基因型TC；图l.miR-26a基因SNPrs7372209位点的电泳分型结果表l.miR-26a基因SNPrs7372209的基因型与等位基因频率在正常男性和无精症患者中的分布基因型/等位基因频率2X正常对照组(n=225)患病实验组(n=90)基因型TT110(0.

11、489)39(0.433)0.7960.372TC85(0.378)33(0.367)0.0340.854CC30(0.133)18(0.200)2.2120.137等位基因T305(0.678)Ill(0.617)2.1410.143C145(0.322)69(0.383)uruTAACATTGTCTCTAGCCCa：基因型TT；b：基因型TC;c：基因型CC图2.miR-26a基因SNPrs7372209位点的基因型测序结果4讨论随着科学界对miRNA认识的深入，人们开始研究miRNA对动物组织各种生理活动的作用。越来越多的研究表明，miRNA与精子的产生、成熟以及睾丸发育都密切相关。精子

12、的产生从精原细胞到成熟精子，任何一个阶段的调控都会影响精子的产生和成熟,每个阶段都涉及到严格的基因调控，是一个复杂的过程。l,5,6JoMicroRNA具有调节基因表达的作用，它是一个短的核甘酸序列17。研究结果表明，miRNA在不同发育阶段的精子和睾丸中表达不同，具有空间和时间特异性18,19。研究还发现睾丸组织中存在丰富的miRNA,miRNA通过调控相关表达来参与精子发生的各个阶段。miRNA通过调节初级精母细胞向精子的分化过程进而影响男性生殖系统的发育。例如，发现MiCrORNA_34bc在受精卵和成熟精子中都有不同的表达程度。来自精子的MicroRNA-34bc通过调节Bcl-2的表达来调控受精卵的第一次分裂20-22。这表明miRNA的异常也许会导致男性不育和精子发生障碍。根据以前在动物中的一些研究发现，miR-26a是近年发现的一种重要的miRNA分子，miR-26a也许在精子发生中起到很重要的作用23,24,25,因此，推测miR-26a可能合精子发生障碍有密切的关系。为了证实上述假设，本次研究对98例无精子症患者和218名正常男性进行了miR-26a共同基因SNPs7372209多态性与无精