保健食品功能检验与评价方法（2023年版）辅助改善记忆.docx

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1、保健食品功能检验与评价方法（2023年版）辅助改善记忆1.1 试验项目1.1.1 动物实验1.1.1.1 体重1.1.1.2 跳台实验1.1.1.1 暗实验1.1.1.4 穿梭箱实验1.1.1.5 水迷宫实验1.1.2人体试食试验1.1.2.1 指向记忆1.1.2.2 联想学习1.1.2.3 图象自由回忆1.1.2.4 无意义图形再认1.1.2.5 人像特点联系回忆1.1.2.6 记忆商3.2 试验原则3.2.1 动物实验和人体试食试验为必做项目。3.2.2 跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验、水迷宫实验四项动物实验中至少应选三项，以保证实验结果的可靠性。3.2.3 正常动物与记忆障碍模型动物任选

2、其一。3.2.4 动物实验应重复一次（重新饲养动物，重复所做实验）3.2.5 人体试食试验统一使用临床记忆量表。3.2.6 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3.3 结果判定3.3.1 动物实验：跳台实验、避暗实验、穿梭箱实验、水迷宫实验四项实验中任二项实验结果阳性。且重复实验结果一致（所重复的同一项实验两次结果均为阳性）可以判定该受试样品辅助改善记忆动物实验结果阳性。人体试食试验：记忆商结果阳性，可判定该受试样品具有辅助改善记忆的作用。辅助改善记忆检验方法1动物实验1.1 跳台实验1.1.1 原理反应箱底铺有通36v电的铜栅，动物受到电击，其正常反应是跳上箱内绝缘

3、的平台以避免伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台，如此训练5min,并记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数,以此作为学习成绩024h或48h重作测验，此即记忆保持测验。记录受电击的动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数。停止训练5天后（也可以在训练后的一周、两周或其它时间点）进行记忆消退实验。1.1.2 仪器与试剂跳台仪：该装置为10X10X60cm3的被动回避条件反射箱，用黑色塑料板分隔成5间。底面铺以铜栅，间距为0.5cm,可以通电，电压强度由一变压器控制。每间左后角置一高和直径均为4.5Cm的绝缘平台。试剂：樟柳碱、东贯若碱、环已酰亚胺、乙醇。

4、1.1.3 实验方法1.1.3.1 实验动物推荐使用近交系小鼠。断乳鼠或成年鼠（18-22g）用于改善老年人记忆的产品必须采用成年鼠。雌雄均可，单一性别，每组10-15只。1.13.2 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.13.3 实验方法及步骤1.1.3.3.1受试样品对正常小鼠记忆的影响末次给样后次日（或一次给样后Ih）开始训练。将动物放入反应箱内（台上、台下）适应环境3min,然后将动物放置反应箱内的铜栅上，立即通以36v的交流电。动物受到

5、电击，其正常反应是跳回平台（绝缘体）以躲避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击又迅速跳回平台上。训练一次后，将动物放在反应箱内的平台上，记录5min内各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期，以此作为学习成绩。24或48h后进行重测验，将小鼠放在平台上记录各鼠第一次跳下平台的潜伏期、各寓min内电击次数和受电击的动物数总数，同时计算出现错误反应的动物的百分率（受电击的动物数占该组动物总数的百分率）停止训练5天后（包括第5天）可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验（方法同重测验）1.13.3.2受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响1.13.3.2.1 造模记忆获得障碍模型

6、制造：训练前IOmin腹腔注射樟柳碱或东蔗若碱5mgkgBW;记忆巩固障碍模型制造：训练前IOmin腹腔注射环己酰亚胺120mgkgBW：记忆再现障碍模型制造：重测验前30min灌胃30%的乙醇10mLkgBW01.1.3.3.2.2记忆测试的操作方法：同1.133.1。1.1.4 数据处理及结果判定潜伏期结果为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，F值&05,结论：各组均数间差异无显著性；F值2R）gP0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据

7、进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。错误次数和3min内跳下平台的动物数均为记数资料，可用下检验，四格表总例数小于40,或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。若受试样品组与对照组比较，潜伏期明显延长，错误次数或跳下平台的动物数明显少于对照组，差异有显著性，以上三项指标中，任一项指标阳性，均可判定该项实验阳性。1.1.5 注意事项1.1.5.1 动物在24h内有其活动周期，不同时相处于不同的觉醒水平，故每次实验应选择同一时相（上午812点或下午14点）1.1.5.2 实验应在隔音，光强度和温、湿度适宜且保持一致的行为实验室进行。1

8、.1.1.1 荐使用纯系动物，实验前数天将动物移至实验室以适应周围环境。1.1.5.4 实验者必须每天与动物接触，如：喂水、喂食和抚摸动物。1.1.5.5 减少非特异性干扰，如：情绪、注意、动机、觉醒、运动活动水平、应激和内分泌等因素。1.1.5.6 考虑动物种属差异。1.1.5.71.2.1 原理利用小鼠嗜暗的习性设计一个装置，一半是暗室，一半是明室，中间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅，并与一计时器相连，计时器可自动记录潜伏期的时间。小鼠进入暗室即受到电击，计时自动停止。1.2.2 仪器和试剂避暗仪：该装置分明暗两室。明室大小为12CmX4.5cm,其上方约20Cm处悬FOW鸨灯丝。暗

9、室较大，大小为17cm4.5cm,两室之间有一直径约3cm的圆洞。两室底部均铺以铜栅。暗室底部中间位置的铜栅可以通电，电击强度可在一旋钮上任意选择。一般采用40v电压。喑室与一计时器相连，计时器可自动记录潜伏期的时间。试剂：樟柳碱、东瓮若碱、环己酰亚胺、乙醇。1.2.3 实验方法1.23.1 实验动物同LL3.11.23.2 2剂量设计和分组同1.1.3.21.23.3 3实验方法及步骤1.23.4 .1受试样品对正常小鼠记忆的影响末次给样后次日（或一次给样后Ih）开始训练。实验时将小鼠面部背向洞口放入明室，同时启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时器自动停止，取出小鼠，记录每鼠从放入

10、明室至进入暗室遭电击所需的时间，此即潜伏期，训练5min,并记录5min内电击次数。24h或48h后重作测验，记录每只动物进入暗室的潜伏期和5min内的电击次数，并计算5min内进入暗室（错误反应）的动物百分率。停止训练5天后可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验。1.23.5 2受试样品对记忆障碍模型小鼠的影响：1.23.6 .2.1模型制造：方法同L1.3.3.2.11.23.7 322操作方法：同123.3.11.2.4 数据处理及结果判定潜伏期时间为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值%05,结论：各组均数间差异无显著性；F值2R）

11、o5,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。5min内进入暗室的次数和5min内进入暗室的动物数均为计数资料，可用片检验，四格表总例数小于40,或总例数等于或大于40但出现理论数等于或小于1时，应改用确切概率法。若受试样品组小鼠进入暗室的潜伏期明显长于对照组，5min内进入暗室的错误次数或5min内进入暗室的动物数少于对照组，且差异有显著性，以上三项指标中任一项指标阳性，均可判定该项实验阳性。1.2.5 注意事项

12、：同1.1.51.3穿梭箱实验（双向回避实验）1.3.1 原理：条件反射1.3.2 仪器与试剂仪器：大鼠穿梭箱。该装置由实验箱和自动记录打印装置组成。实验箱大小为50cm16cm18cm。箱底部格栅为可以通电的不锈钢棒,箱底中央部有一高1.2Cm挡板，将箱底部分隔成左右两侧。实验箱顶部有光源和蜂鸣音控制器，自动记录打印装置可连续自动记录动物对电刺激（灯光或/和蜂鸣器）的反应和潜伏期，并将结果打印出来。试剂：樟柳碱，东苴若碱,环己酰亚胺，乙静1.3.3 实验方法13.3.1 实验动物Wistar或SD大鼠，断乳鼠或成年鼠，雄、雌均可。13.3.2 剂量设计和分组同1.132。13.3.3 3实验

13、方法及步骤13.3.3.1受试样品对正常大鼠条件反射建立的影响末次给样后次日（或一次给样后Ih）开始训练。将大鼠放入箱内任何一侧，20s后开始呈现灯光或蜂鸣音，持续20s,后IOs内同时给以电刺激（IOoV,0.2mA,50Hz,AC）大鼠在遭电击后即逃避，必须跑到对侧顶端，挡住光电管后才可中断电击，此为被动回避反应，在每次电击前给予条件刺激，反复强化后，大鼠在接受条件刺激后即跳向对侧并挡住光电管而逃避电击，此为主动回避反应，每隔天训练一回，每回50次，连续训练4-5回后，动物的主动回避反应率可达8090%以上。根据打印结果分析如下指标：动物反应次数，动物主动回避时间，动物被动回避时间，动物主

14、动回避率。停止训练5-50天内，分23次测定其记忆消退情况。受试样品对记忆障碍模型大鼠条件反射建立的影响。1.3.3.3.2.1模型制造：同1.13.3.2.11.3.3.322操作方法：同13.33.lo1.3.4数据处理及结果判定动物主动回避时间和被动回避时间为计量资料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，产值用.05,结论：各组均数间差异无显著性；产值2Fo.o5,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差

15、齐的目的，改用秩和检验进行统计。若实验组主动和/或被动回避时间明显短于对照组，差异有显著性，可判定为该指标阳性。1.3.5注意事项同1.1.5。1.4水迷宫实验1.4.1 原理动物都有一种“探索”和“更替”倾向，当离开一个臂时，总是跑向“久”未跑过的“新”臂。小鼠不愿在水中，因而寻找能爬出水面的阶梯，训练后，小鼠能记住找到阶梯的路线。1.4.2 仪器与试剂水迷宫自动记录仪。该仪器是由迷宫游泳箱和自动记录仪两部分组成。迷宫游泳箱由聚乙烯塑料制成，长100cm、宽100cm高30cm；内径长90cm、宽90cm高30cm,泳道宽12cm,泳道走向固定。见附图。1.4.3 实验方法1.43.1实验动物推荐使用近交系小鼠，断乳鼠或成年鼠，单一性别，雌雄均可。1.4.3.2剂量设置、给样途径和期限均同l.l.3.2o1.43.3实验方法1.43.3.1 受试样品对正常小鼠记忆的影响连续给样30天，末次给样次日开始训练。训练期间继续给样，每天一次。迷宫泳道水深9cm,水温约20（415C）将小鼠训练时间限定为2min,在2min内未到达终点的小鼠均记为2min。第一次训练前将小鼠放在梯子附近，使其自动爬上3次。以后每次训练前将小鼠放在梯子附近,背朝楼梯，使其自动爬上1