最新新生儿疾病串联质谱筛查技术专家共识.docx

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1、最新新生儿疾病串联质谱筛杳技术专家共识采用串联质谱技术(tandemmassspectrometry,TMS)检测新生儿滤纸干血片中数十种氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平，筛查氨基酸代谢障碍、有机酸血症及脂肪酸氧化代谢障碍等多种遗传代谢病，已广泛应用于新生儿出生缺陷的防治。为了规范我国利用串联质谱技术进行新生儿疾病筛查的实验室技术各环节，卫生部临床检验中心新生儿疾病筛查室间质评专家委员会组织专家，参照国内外最新文献与指南，制定本版新生儿疾病筛查串联质谱技术专家共识，用以督促各实验室加强质量管理，提供标准化的筛查服务，以促进串联质谱技术在新生儿疾病筛查中的规范应用口，2,3】。一、串联质谱技术新

2、生儿疾病筛查概况(一)筛查实验过程利用串联质谱技术对收集的婴儿足跟干血斑(driedbloodspot,DBS)样本中的分析物进行检测。DBS样本中加入含有对应的内标的提取液，在适当的提取时间之后，转移提取物，去除残留DBS样本。提取液可被直接分析(非衍生化法)或经衍生化后再进行分析，以提高一些化合物检测的灵敏度。分析时，提取物经流动注射方式被引入到质谱仪并进行分析，无需对分析物进行前期层析分离。串联质谱仪通过组合三台四极质量分析器对目标分析物(例如，氨基酸、酰基肉碱)进行检测，第一个四极杆质量分析器对目标分析物进行检测，第二个四极杆质量分析器对目标分析物进行碎裂处理，第三个四极杆质量分析器对

3、目标分析物的碎片离子进行分类排列，这个过程被反复执行，从采样到完成检测的整个分析过程总时间一般不超过到2min（5o样本中分析物的浓度通过计算每个分析物和已知浓度的内标物之间的信号强度比率而得到。结果分析时通过关联每种目标分析物对应的疾病种类，进行综合分析。结果报告应简洁明了，同时注意时效性。（二）工作流程根据新生儿疾病筛查管理办法（卫生部令第64号）及新生儿疾病筛查技术规范（2010版）的要求6,7,基于串联质谱技术的新生儿疾病筛查（newbornscreening,NBS江作必须在省、自治区、直辖市人民政府卫生行政部门指定的新生儿遗传代谢病筛查中心开展。实验室筛查工作流程符合规范要求，并制

4、定从样本接收到报告解读及随访复查整个环节的标准操作流程，以便于对整个筛查流程进行监控，确保筛查质量（图1）891。召回复查，必要时进行短期随访实验重做 问勒排瓷实验重做 问题排查图1串联质谱技术用于新生儿疾病筛查工作流程二、试剂及内标用于NBS的主要试剂须取得国家食品药品监督管理总局的产品注册证（一）试剂1.试剂要求：（1）所有试剂要求色谱级或以上级别；（2）实验室应建立商品化试剂的验收程序，并完成检验程序的确认和验证；（3）试剂应标明批号、储存条件和稳定性（有效期限），建立使用记录及余量信息；（4）应根据健康和安全要求制定有毒有害物质处理程序，危化品保存与管理程序，填写相关记录文件，保护实验

5、人员安全。2.试剂组成：筛查试剂由萃取试剂、流动相、衍生化试剂（衍生化法）、复溶试剂组成。（1）萃取试剂：纯甲醇或甲醇和水的混合物组成，添加（1%）的有机酸（如乙酸或甲酸）以帮助分析物电离；（2）衍生化试剂：盐酸正丁醇，由正丁醇和乙酰氯按一定比例配制；（3）复溶试剂：主要成分为流动相，或类似流动相配比的混合液；（4）流动相：主要成分为乙睛或甲醇的溶液。以一定比例（例如20%）与水和少量（1%）有机酸如乙酸或甲酸混合。如果使用商品化试剂盒，则按说明书操作。（二）内标采用分析指标的稳定同位素标记物作为内标，由相应的稳定同位素取代化学结构中的两个或多个原子制备而成（表1）。当分析物没有相应的同位素内

6、标时，可以用一个适当标记的接近类似物来替代，替代的内标应与被分析物存在至少2个质量单位的差异，以避免潜在的峰重叠（表1）【叫在选择内标时，应避免使用位于不稳定位置的定标记内标（如-OH或-NH2）。为避免加样误差，内标一般与萃取试剂混合后使用。表1常见目标分析物及内标品咖堂内标行*分析物近做同位堂内痔AJaC3DCd3-C4ASPAspC40H(J3C4QuC40CMecd3*MetC5-0H(heC5:ldM5Tyr13Q-TvrC50Cd6-C5OCLavDe/ProOHd3-LeuC60Hd6C5DCProl5-Pr0C60CdW5DCQyIsNzI3cSC8:ld38Omd6-0m01

7、0:1d3-C10Vdd8-VaClO:2d3*C10AfgdSWgmid312Otd2XCl4:1d9-C14SA13C5-MPC14:2d9OHd316C3(C3Cl6:1(J3-C16C434C16-0H似16C5d9C5C18:ld318C6(OY6CI8:2d3-C18C8Ciaa-OHd3-C18ClOd3C10Cld-OHd318C12d3-C12-C14d3-CM-C16d3163-C18-注：（SA）I3（5三-lH-n-W;内用（MPP）:5抚丽酚MUS8（21眄耳表1常见目标分析物及内标品三、样本处理酰基肉碱和氨基酸均可以通过衍生化（酯化，主要是丁基酯）或非衍生（非酯化，

8、游离酸）两种方法来分析，但两种方法实验流程不同，检测能力各异，实验室应综合考虑配套设施、安全防护及项目需求等情况进行合理选择口2/3。（一）衍生化法衍生化法处理步骤：（1）准备包含内标的萃取溶液（2状干血斑样本上打出血斑（约3.2mm）;（3）将血斑置于96孔板中；（4）使用校准的移液器或液体处理装置，添加萃取溶液的等分试样到每孔，孵育合适时间；（5）贴上封片以减少蒸发，摇动孵育平板，使萃取溶液与血斑相互作用；（6）萃取后符血斑洗脱液转移到干净耐热的96孔板上,留下剩余的血斑（7）在通风橱中用氮气吹干或加热蒸发萃取溶液；（8）通过加入衍生化试剂，与吹干的代谢物进行反应；（9）封盖96孔板，并在

9、合适的烘箱中或恒温孵育器中加热至约（62.52.5）z孵育15min;（10）取出96孔板,在4555。C用氮气吹干或蒸发衍生化试剂；但应避免吹干过度造成降解；（11）用复溶试剂溶解干燥的分析物，并密封96孔板；（12）将96孔板置于串联质谱仪自动进样器中进行后续分析。（二）非衍生化法非衍生化法处理步骤：（1）准备包含内标的萃取溶液；（2）从干血斑标本上打出血斑（3.2mm）;（3）将血斑置于96孔板中；（4）使用校准的移液器或液体处理装置，添加萃取溶液的等分试样到每孔，孵育合适时间；（5）贴上封片以减少蒸发，摇动孵育平板，孵育合适时间，使萃取溶液与血斑相互作用；（6）取出96孔板每孔转移适量

10、萃取液至新的耐热96孔微孔板,铝箔覆盖，以防挥发；（7）如果测试琥珀酰丙酮，含转移液的微孔板需静置至少2h（87等96孔板置于串联质谱仪自动进样器中进行后续分析。（三）检测指标设置1.基于串联质谱技术的新生儿疾病筛查中氨基酸、游离肉碱、酰基肉碱检查指标的设置见表2olIMJM2WGMlUU.UUmi*MtmjM4O*m2lmias*IUlIMlylttm.i*jUS4WCCJtM*WFNItt4Jaa川MCl*saHaXMJOoCm4MOJ7MiC4mi3M2C*4MmamzzlM0iT*mtacccMtlT=MiccMU1M3Qamjm2*2戊二院加CSoC276.1388.3）丁二联肉33

11、I5Bg肉C40C*CS)H262.1-己院肉C6260.2316.3OOC290.2402.3aXZMWM+3B5JRC5DCC6X276.1三裁为MC8288.2344.3室由为*C8：l286.2342.35f三三ClO316.3372.3矽燃耐Hcio：i314.2370.3誉二途联内C10：2312.2368.3（月发东和）C12344.3400.3十二Im旗就（月慢烧!梦He）C2：l342.3398.30三Bv三3(SHWOC1437234284十四险怪限枇无票交蜒）CI4：1370.3426.4+EWrnWW(无MER货款)CI4：2368.3424.33理务十N被三肉款(3-

12、三W三JMWM)CBOH388.3444.4十六族三视C16400.3456.4十六豺嗨视（憔慢!襁克延）C16：l398.3454.43-STWMtoM(3-三WWM)C16：1-OH4143470.43必塞十六毅#内。尼三EM）C160H416.3472.4十八藐触目喇（!三ftOCIS428.444.4十八*叽（碱理）CI8：1426.4482.4十八弟二曲内（5LBflM）CX8：2424.3480.43火扇十八破蜗炳C18：1-OH442.4498.4举里瓦十八表如32基硬S11R为M:C18OH444.4500.4注：酝娱用mE4ij生方法不H区分的脚S.H测7f可根或新用西5或为

13、t冷血行AW：b裳子非E（.但早XMJH3rt蛉：霍行三司,可以利用联质募8行MTXB*e1WJU族2分别代寰用为生方fjrfa行生方5?防.不能区分S0分野种必：.囊呆I昉生化或行生化方法来设?一表2串联质谱技术新生儿疾病筛查氨基酸、游离肉碱、酰基肉碱等指标设置2.串联质谱技术新生儿疾病筛查中设置检测指标相互间比值，可以提高对某些疾病诊断的准确性，相关比值的设置见表3o表3建议设的氧甚酸及蚓C肉碱间比值超标殡/酸比值*跳H为黄比笛孱以限H内笠比值揄J酷要坳i比也俄日Arg0mC3MtC5aC1C1C124AraPhe08C5waC12/C3GUAeC5OVC8C14/GWPheC3/C16C5DC/OCWiyaaawotC3DQC4C5DC/C5OMC4OH/C16aG1WwC30C/C10C5DC/OOCC4OH/C8OyjWie30C50C/CSC16/C3PhMMeC4/C3CW3C18/C3