肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范-标准编制说明.docx

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1、中国实验动物学会团体标准实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范编制说明中国实验动物学会团体标准实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范编制说明（一）工作简况，包括任务来源、协作单位根据中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会2022年3月22日下达的关于征集2022年实验动物标准化建议及标准立项的通知，湖南中医药大学牵头，组织华中科技大学同济医学院、广州医科大学、湖南师范大学附属湖南省人民医院共4家单位协作完成了实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范团体标准的起草工作,（二）主要工作过程、标准主要起草人及其所做的工作等中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会2022年关于征集2

2、022年实验动物标准化建议及标准立项的通知下达后，湖南中医药大学牵头，组织华中科技大学同济医学院、广州医科大学、湖南师范大学附属湖南省人民医院共4家单位开展了标准的起草、修改及验证工作。起草组成员包括戴爱国教授、胡清华教授、王健教授、蒋永亮教授、胡瑞成教授、易健副研究员，上述成员分别从事多年肺动脉高压疾病研究、实验动物标准起草、疾病动物模型研究等本标准起草相关研究工作，具有一定的知识储备和经验积累。起草组讨论形成了编制工作计划、编制原则和指导思想。（三）标准编写背景；1 .肺动脉高压肺动脉高国PUImOnaryhyPertenSiOn,PH）是指由多种异源性疾病（病因）和不同发病机制所致肺血管

3、结构或功能改变，引起肺血管阻力和肺动脉压力升高的临床和病理生理综合征，继而发展成右心衰竭甚至死亡，不经治疗本病死亡率非常高。临床上，肺动脉高压分为5类：动脉性PH（pulmonaryarterialhypertension,PAH）、左心疾病导致的PH、肺病和/或缺氧导致的PH、慢性血栓栓塞性PH（chronicthromboembolicpulmonaryhypertension,CTEPH）和（或）其他肺动脉阻塞性病变所致PH、未明和（或）多因素所致PHo尽管不同亚类PH的病因不同，但都表现出相似的病理变化，包括肺血管内侧肥大、内膜增生和纤维化、外膜增厚伴随中度血管周围炎症细胞浸润、丛状扩

4、张性病变以及原位血栓形成，肺血管不断增生、重构使血管部分闭塞，肺血管阻力增加，导致进行性右心衰竭和功能衰退，甚至死亡。随着PH细胞分子学机制研究的不断深入和新兴药物的开发，患者的临床症状和预后都会有很大的改善，然而消除低氧是不可能的，且由于低氧所致肺血管收缩和重塑的渐进和不可逆性，当前仍是临床上治疗的难点，目前很多新兴药物（比如伊洛前列素、激酶抑制剂等）不但价格昂贵，还伴有多种并发症及副作用，临床普及面低，因而探索新的治疗途径和治疗方法意义重大，也很有必要。深入探讨PH的病因、病机、开发新的治疗靶点是亟待解决的关键问题。PH动物模型是研究PH发病机制和药物开发的重要载体。随着PH研究的深入，目

5、前已经构建了多种动物模型，但缺乏统一的制备方案和评价标准。PH模型制备和评价方法的规划范和标准化，将为进一步阐明PH的病理机制、提高PH患者的预后、探索新的治疗靶点提供基础。2 .前期研究基础我们的团队长期致力于肺动脉高压发病机制及防治研究，以肺血管损伤为研究核心，根据不同肺动脉高压的发生因素，目前已建立了香烟烟雾诱导性PH模型、低氧性PH模型、野百合碱诱导性PH模型以及复合型PH模型，从一般情况、血液生化、心肺血流动力学检测、病理特征等不同维度构建了肺动脉高压动物模型评价体系。相关研究获国家自然科学基金资助项目7项，发表与本研究有关论文300余篇。获国家教育部科技进步奖一等奖等多项奖励。3

6、.相关标准：我们查阅了中国实验动物学会信息库、中国实验动物标准化委员会制定的标准，国家军用标准全文数据库系统、国家科技部和解放军原总后卫生部发布的与实验动物相关的技术标准。目前并无肺动脉高压动物模型相关的标准规范。（四）标准编制原则；本标准的制定主要遵循以下原则：一是本标准编写格式应符合GB/T1.1和中国实验动物学会团体标准编写规范；二是科学性原则，在尊重科学前期研究基础上制定本标准，结合国内外大量参考文献，提出具体可量化的评价指标，使得制订的技术规范达到可操作、可评判；三是可操作性和实用性原则，所有造模方法和检测指标均便于使用单位操作，且经过多家单位的验证，便于推广应用；四是适用性原则，所

7、制定的诊断规范应适用于肺动脉高压大鼠模型的评价；五是协调性原则，所制定的技术规程应符合我国现行有关法律、法规和相关的标准要求，并有利于肺动脉高压动物模型的规范化和科学化。（五）确定标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据），修订标准时，应增列新旧标准水平的对比；本项目主要内容包括制定肺动脉高压模型制备及评价相关术语;肺动脉高压模型制备及评价所需的检测设备、检测方法、测试时间和评价指标。本标准由范围；规范性引用文件；术语及定义；肺动脉高压动物模型制备和评价技术要求共五部分构成。现将“实验动物肺动脉高压动物模型制备和评价技术规范”征求意见稿主

8、要技术内容说明如下：1不同类型肺动脉高压动物模型制备原理和方法肺动脉高压模型的建立方法主要有以下几种：利用低氧诱导肺动脉高压模型；利用药物、异物诱导肺动脉高压模型；通过手术分流建立肺动脉高压模型；借助基因工程建立肺动脉高压模型；混合干预建立晚期肺动脉高压模型等。目前PH动物模型仍不能全面模拟人体的发病特点，各种造模方法仍可优化和改进。本标准选取的以下五种造模方法，兼顾了肺动脉非特异性内膜和外膜增厚的经典模型（即低氧、MCT,香烟烟雾）以及丛状病变的更合模型（n5416缺氧、MC17缺氧）两大类，这五类模型都可以采用统一的标准进行量化评估，研究者根据疾病的不同病因和不同阶段选择合适的动物模型。1

9、.1 野百合碱诱导大鼠肺动脉高压模型1.1.1 实验原理野百合碱（monocrotaline,MCT）在经过大鼠肝脏细胞色素P450系统代谢后生成野百合碱毗咯，进而造成肺血管内皮细胞损伤和炎症，导致肺动脉高压的发生发展。1.1.2 模型建立技术要求和注意事项所有大鼠随机分为两组，即模型组和对照组。模型组：给予大鼠一次性腹腔注射（ip）MCT,推荐注射剂量为60mgkg-,o对照组：一次性腹腔注射（ip）等体积的生理盐水，4周后进行相关指标检测。McT注射剂量的注意事项：一般情况下，单次注射MeT（60-80mgkg-1）足以诱导肺动脉高压的病理特征，降低MCT的剂量（20-40mgkgT）相应

10、会降低肺血管重塑的程度，使大鼠产生适应性右心室肥大，与人类肺动脉的逐渐加重相反，大鼠的肺动脉高压会在4周后逐渐自发逆转。值得注意的是大鼠在单次注射腹腔注射MCT的6-8周后死亡率很高。1.2 慢性缺氧诱导肺动脉高压动物模型1.2.1 实验原理由于肺泡长期广泛缺氧导致肺小动脉收缩、肺动脉平滑肌增殖、肺血管炎症等造成肺血管重塑，导致肺动脉高压的发生发展。1.2.2 模型制备技术要求所有动物随机分为两组，即模型组和对照组。模型组：大鼠放入低氧舱（氧气浓度10%0.5%,湿度为60%0.5%）,每天低氧处理8小时，不间断重复4周。对照组：老鼠放在在相同室内环境中，不做任何处理，自由饮食。所有动物都饲养

11、在同一个房间内，暴露在相同的明暗循环和环境温度下，并被安置在标准的老鼠笼（三只大鼠/笼子）中，可以自由获取食物和水。1.3 咤0115416/缺氧（SUHX）诱导肺动脉高压动物模型1.3.1 实验原理Sugen5416（SU5416）是VEGFR-2受体抑制剂，在慢性缺氧大鼠中，SU5416可诱导肺血管内皮细胞死亡和功能障碍，促进内皮细胞转化为凋亡抵抗表型，增殖的内皮细胞引起动脉管腔闭塞，导致严重的肺动脉高压发生。132模型制备技术要求所有动物随机分为两组，即模型组和对照组。用按甲基纤维素（CMC）的稀释剂配备SU5416注射液。模型组：给予大鼠一次性皮下注射SU5416（20mgkg-）,并

12、低氧（氧气浓度10%0.5%,湿度为60%0.5%）处理8小时，不间断重复3周。在21天结束时，将大鼠返回室内空气（正常氧）再持续2周。对照组：老鼠放在在相同室内环境中，不做任何处理，自由饮食。5周后进行相关指标检测。所有动物都饲养在同一个房间内，暴露在相同的明暗循环和环境温度下，并被安置在标准的老鼠笼（三只大鼠/笼子）中，可以自由获取食物和水。1.4 香烟烟雾诱导肺动脉高压模型1.4.1 实验原理吸烟者容易发生肺动脉高压，并且不少吸烟的慢性阻塞性肺疾病患者在患病初期，未发生明显缺氧时己存在肺小血管重塑。因此，香烟烟雾可直接引起肺小血管重塑，导致肺动脉高压的发生发展。143模型制备技术要求所有

13、动物随机分为两组，即模型组和对照组。吸烟模型组大鼠置于香烟烟雾染毒箱（需有通气孔）内接受香烟烟雾刺激，每天2次，每次燃12支香烟，维持箱内烟雾量lh。所用香烟规格为：烟气烟碱量0.6mg、焦油含量9mg、烟气一氧化碳量Ilmg。为了避免缺氧对实验的影响，同时需要监测箱内氧浓度（氧浓度维持在18-21%）,基本可排除缺氧对本模型的影响。在箱内安装烟雾探测器，用于监测造模期间箱内CO浓度，CO浓度维持在80（MOOOPPm左右为宜。每周造模5天，连续造模4个月后进行相关指标检测。1.5 MCT/缺氧诱导肺动脉高压动物模型1.5.1 实验原理同1.1与1.2中的实验原理。152模型制备技术要求所有动

14、物随机分为组，即模型组和对照组。模型组大鼠一次性腹腔注射（ip）60mgkg-1的MCT后置于低氧舱（氧气浓度10%0.5%,湿度为60%0.5%）,每天低氧处理8小时，不间断重复4周。对照组：老鼠放在在相同室内环境中，不做任何处理，自由饮食。所有动物都饲养在同一个房间内，暴露在相同的明暗循环和环境温度下，并被安置在标准的老鼠笼（三只大鼠/笼子）中，可以自由获取食物和水。4周后进行相关指标检测。2肺动脉高压动物模型模型共性评价技术要求不同亚类PH的病因不同，但都表现出相似的病理变化，包括肺血管内侧肥大、内膜增生和纤维化、外膜增厚伴随中度血管周围炎症细胞浸润、丛状扩张性病变以及原位血栓形成，肺血

15、管不断增生、重构使血管部分闭塞，肺血管阻力增加，导致进行性右心衰竭和功能衰退，甚至死亡。因此我们在模型评价时，除了对模型动物的血流动力学进行常规检测之外，还重点对右心肥厚指数及肺血管重塑进行重点评估，用以评估疾病病程长短、严重程度的不同，种属特异性，血流动力学状态以及血管损伤性质的对肺动脉高压的影响。2.1 模型的一般症状观察要求观察大鼠活动及呼吸情况，精神状态，毛发颜色，营养状态等，有无异常表现，并及时记录大鼠体质量变化和患病或死亡情况。2.2 模型心、肺血流动力学检测2.2.1 具体检测指标- 右心室收缩压（RVSP）- 平均肺动脉压（mPAP）- 三尖瓣瓣环收缩期位移（TAPSE）右心室

16、舒张末期横径（RVEDD）- 右心室舒张末期纵径（RVEDL）- 右室舒张末横、纵径之比（RVEDD/RVEDL）肺动脉血流加速时间（PAAT）- 右心室游离壁厚度（RVFWT）2.2.2检测技术要求（1）超声心动图检测检查操作前准备：因为大鼠太大而无法在其清醒时手动约束，所以在进行超声心动图之前需对大鼠进行麻醉；使用3%异氟烷吸入诱导麻醉，以1%-1.5%异氟烷加100%氧气维持麻醉;使用金霉素软膏等或动物用软音涂抹大鼠的眼睛，防止麻醉后干燥；使用脱毛膏脱去大鼠胸部及右侧颈部的毛发；将动物放在手术平台上，保持仰卧位；下面放置一个加热垫，并设置加热水平以维持37-37.5C的体温（因为体温过低会导致明显的心动过缓，而体温过高会导致明显的心动过速