夏洛莱羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范.docx
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1、ICS65.120CCSB46B21辽宁省地方标准DB21TXXXX-XXXX夏洛莱羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范点击此处添加标准名称的英文译名(征求意见稿)XXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施辽宁省市场监督管理局发布*刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位:锦州医科大学、朝阳市朝牧种畜有限公司、吉林大学、辽宁省农业发展服务中心。本文件主要起草人:王春强、张贺春、李纯锦、马巍、韩迪、
2、李宁、张拮。本文件发布实施后,任何单位和个人如有问题和意见建议,均可以通过来电和来函等方式进行反馈,我们将及时答复并认真处理,根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址:辽宁省农业农村厅(沈阳市和平区太原北街2号),联系电话:024-23447862。标准起草单位通讯地址:锦州医科大学(辽宁省锦州市古塔区松坡路40号),联系电话:024-23264599o夏洛莱羊体外胚胎生产及手术法胚胎移植技术规范1范围本标准规定了夏洛莱羊体外胚胎生产主要环节技术规范。本标准适用于夏洛莱羊种羊扩繁体外胚胎的生产及移植。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其
3、中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。11供体羊donor指提供胚胎的母羊。受体羊recipient指接受胚胎的母羊。a1体外胚胎生产invitroembryoproduction指对母体进行激素处理,通过活体采卵或屠宰场摘取卵巢后采集卵母细胞,在体外条件下对卵母细胞进行成熟培养、体外受精、体外培养、获得可用胚胎,并将胚胎移植至同期发情受体,或冷冻的过程。羊胚胎移植技术。Vineembryotransfertechnology将良种母羊体内早期胚胎或体外受精及其他方式获得的早
4、期胚胎,移植到同种生理状态相同的受体母羊体内,使之继续发育成个体的技术。4供体绵羊的选择与饲养管理A1选择条件按照NY/T1571对供体羊进行选择。49饲养管理按照DB65/T4073-2017对供体羊进行饲养管理。5供体羊的激素处理所需药品见附录A。A5激素处理方法放入海绵栓或CIDR(含孕激素阴道栓)之日,作为发情周期的第。天,在第9天开始注射FSH,每天早、晚各注射1次,中间间隔约12h,连续3d,递减注射。注射第6次后间隔12h,对供体绵羊回收卵母细胞后取出海绵栓。参见附录B.6手术法活体采卵、屠宰后摘取卵巢采卵A1手术法活体采卵手术部位在离乳房前端约2Cnl处,腹中线大约6Cnl的左
5、侧或右侧位置,按下列要求执行:a)注射第5次FSH时开始空腹(手术前空腹24h),禁饮禁食;b)麻醉及保定:根据绵羊体重,肌肉注射静松灵0.3mi-0.5mL,将其仰卧在手术架上并用绳索保定;c)使用肥皂水湿润手术部位的羊毛,刮毛刀刮去羊毛,并用水清洗干净:d)用2%-4%碘酊消毒手术部位,并停留5min;e)用75%酒精对手术部位脱碘、晾干;f)手术创布覆盖羊体;g)避开血管,用手术刀纵向切开3m5三长的刀口,将皮下结缔组织分离,暴露肌膜。再用刀柄后端将肌肉层和腹膜钝性分离;h)食指和中指从刀口进入,在骨盆腔、耻骨前沿触摸子宫角,并将子宫、卵巢引出刀口外;i)用吸有抽卵液的10ml注射器抽取
6、突出卵巢表面的卵泡,边缘用纱布止血。回收卵泡液约6mL左右时,推入经抽卵液湿润的圆底试管,并放入37C水浴锅沉淀;j)在体视镜下捡出所有卵母细胞。69屠宰后摘取卵巢采卵a)注射FSH第6次后的12h,将待屠宰羊拉至屠宰场屠宰;b)在37C水浴锅中预热生理盐水,并在生理盐水中加入青霉素和链霉素各半瓶,倒入保温杯;c)将屠宰Ih内的卵巢用剪刀剪下,放入保温杯中,运回实验室内;d)在实验室内完成后期的所有操作;e)用剪刀将卵巢周围的结缔组织去除干净,38C生理盐水清洗卵巢3次,并浸泡于生理盐水中;f)用吸水纸吸附卵巢上的盐水,再用吸有抽卵液的注射器抽吸突出卵巢表面的卵泡;g)将抽完卵泡的卵巢至于60
7、mm平皿内,在平皿内加入2ml抽卵液,用刀片密集划破卵巢表层,并在抽卵液中涮洗:h)在体视镜下捡出所有卵母细胞;7卵母细胞的体外成熟培养将捡出的卵母细胞用干净的抽卵液洗涤3次,再用IVM液(卵母细胞成熟培养液)洗涤3次,按50枚/孔80枚/孔的密度,放入0.6L/孔IVM液并覆盖0.3InL矿物油的四孔板内。其中所用IVM液需在38.6、5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中平衡3h.8体外受精A1鲜精受精8.1.1 对种公羊的选择按照DB65/T4073-2017对种公羊进行选择。8.1.2 采精a)采精前对种公羊外生殖器清洗消毒;b)采精后用精液稀释液按1:1稀释,放入30C的水杯中,置于
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