第三章真核细胞周期调控的分子机制.ppt

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1、 第十九章第十九章 真核细胞周期调控的分子机制真核细胞周期调控的分子机制2001年年10月月8日美国人日美国人LelandHartwell、英国、英国人人PaulNurse、TimothyHunt因对细胞周期调因对细胞周期调控机理的研究而荣获控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖诺贝尔生理医学奖第一节第一节 细胞周期及调控的概述细胞周期及调控的概述细细胞胞周周期期间期间期(interphase)分裂期分裂期(M)G1期期(合成前期合成前期)S期期(DNA合成期合成期)G2期期(合成后期合成后期)前期前期(prophase)中期中期(metaphase)后期后期(anaphase)末期末期(telo

2、phase)一、细胞周期一、细胞周期(cell cycle)有丝有丝分裂分裂(mitosis)胞质分裂胞质分裂(cytokinesis)细胞周期的不同时相细胞周期的不同时相(phase)G0裂殖酵母裂殖酵母二、细胞周期调控的主要分子机制二、细胞周期调控的主要分子机制 细胞周期引擎细胞周期引擎异二聚体蛋白激酶复合体异二聚体蛋白激酶复合体包括二个亚单位：包括二个亚单位：调节亚单位：调节亚单位：细胞周期蛋白细胞周期蛋白（cyclin）cyclin浓度随细胞周期不断变化浓度随细胞周期不断变化 催化亚单位：催化亚单位：细胞周期蛋白依赖性激酶细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkina

3、se，CDK)-CDK单独存在时无活性，与单独存在时无活性，与cyclin结合才结合才具有激酶的活性具有激酶的活性;-cyclin不仅起激活不仅起激活CDK的作用，还决定了的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化。何时、何处、将何种底物磷酸化。三种控制细胞周期进程的细胞周期蛋三种控制细胞周期进程的细胞周期蛋白白-CDK复合体：复合体：G1、S期和有丝分裂期和有丝分裂-CDK复合体复合体 （G1-CDK复合体的合成和活性的调节复合体的合成和活性的调节是细胞周期的主要调控机制）是细胞周期的主要调控机制）前复制复合体（前复制复合体（pre-replicationcomplex，pre-RC

4、）：其磷酸化既可启动其磷酸化既可启动DNA的复制，的复制，又可防止新的前复制复合体组装又可防止新的前复制复合体组装翻译后调节机制：翻译后调节机制：蛋白磷酸化、泛素依赖的蛋白降解蛋白磷酸化、泛素依赖的蛋白降解三、研究细胞周期调控的实验体系三、研究细胞周期调控的实验体系（一）细胞的（一）细胞的DNA含量提示其所处的细胞周含量提示其所处的细胞周期时相期时相用与用与DNA结合的荧光染料处理细胞，结合的荧光染料处理细胞，再用流式细胞术再用流式细胞术(FCM)测定每一细胞的测定每一细胞的DNA含量。含量。荧光激活的细胞分选仪（荧光激活的细胞分选仪（FACS)（二）细胞融合实验（二）细胞融合实验（三）互补实

5、验（三）互补实验G0+G1SG2+MG0+G1SG2+MControlDrug-treated细胞周期阻滞于细胞周期阻滞于S期期ControlG0+G1G0+G1G0+G1G0+G1G2+MG2+MG2+MG2+MSSSS细胞周期阻滞于细胞周期阻滞于G2期期参与细胞周期调控的分子参与细胞周期调控的分子第二节第二节一、细胞周期蛋白（一、细胞周期蛋白（cyclin）种类：种类：目前分离出目前分离出30余种余种脊椎动物：脊椎动物：A1-2、B1-3、CD1-3、E1-2、F、G、H等等人类：人类：A、B、C、D、E。分类：分类：不同时相发挥作用不同时相发挥作用G1周期蛋白周期蛋白：在：在G1期发挥作

6、用（期发挥作用（C D E）（S和）和）M期周期蛋白期周期蛋白：A B 在在G2/M调控点发挥作用调控点发挥作用 一、细胞周期蛋白（一、细胞周期蛋白（cyclin）共同结构：共同结构：均含有一段约均含有一段约100150个氨基酸的保个氨基酸的保守序列，称为守序列，称为周期蛋白盒（周期蛋白盒（cyclinbox)，是与是与CDK结合的关键区。结合的关键区。功能：功能：不同的不同的cyclin识别不同的识别不同的CDK，组成，组成不同的不同的cyclin-CDK复合物，表现出不同的复合物，表现出不同的CDK激酶的活性。激酶的活性。G1周期蛋白周期蛋白表达顺序：先表达顺序：先cyclinCD，再，再

7、cyclinEcyclinD和和E，为细胞通过限制点所，为细胞通过限制点所必需必需 cyclinD亚类：亚类：D1D2D3 cyclinDCDK：4、6 cyclinD功能：功能：使下游蛋白磷酸化使下游蛋白磷酸化如：如：CDK4/6-cyclinD使视网膜母细胞瘤使视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化）蛋白磷酸化释放转录因子释放转录因子E2F促进促进CDK2、cyclinE表达表达进一步磷酸化进一步磷酸化Rb阳性反馈回路阳性反馈回路*此时细胞周期不依赖此时细胞周期不依赖CDK4/6-cyclinD复合体的活性复合体的活性细胞周期的调控细胞周期的调控CDK1/Cyc B

8、*CyclinD和和E在在G1期表达，为细胞期表达，为细胞通过限制点所通过限制点所必需必需S和和M期周期蛋白期周期蛋白合成顺序：合成顺序：A早于早于B（1）cyclinA：与与CDK1和和CDK2形成复合物形成复合物（2）cyclinB 亚类：亚类：B1B2B3 合成：合成：在胚胎细胞周期中连续合成，但在有丝在胚胎细胞周期中连续合成，但在有丝分裂分裂后期（晚期）后期（晚期）迅速降解。迅速降解。？CDK：1二、细胞周期蛋白依赖性激酶（二、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）种类：种类：目前动物中发现目前动物中发现9种种，人类，人类7种种（17)共同结构：共同结构：相似的相似的激酶结构域激酶结构域，是

9、一段，是一段保守序列保守序列，与，与周周期蛋白期蛋白的结合有关。的结合有关。至少有两个结构域：至少有两个结构域：T-loop、ATP结合位点结合位点 激活：激活：Cyclin与与CDK结合为结合为CDK发挥酶活性所发挥酶活性所必需必需 但但CDK 仅与仅与Cyclin 结合结合并不能并不能使使CDK激活激活 只有只有T-loop 中的中的Thr161残基磷酸化残基磷酸化才能使才能使CDK激活。激活。二、细胞周期蛋白依赖性激酶（二、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）功能：功能：在不同细胞时相，在不同细胞时相，特定的特定的CDK与与特定特定的的cyclin形成细胞周期特异的蛋白激酶形成细胞周期特异的

10、蛋白激酶复合体，调节细胞周期进程。复合体，调节细胞周期进程。激活的激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应。相应的生理效应。脊椎动物细胞脊椎动物细胞CDK-细胞周期蛋白复合体细胞周期蛋白复合体CDK细胞周期蛋白细胞周期蛋白功能功能CDK1cyclinB1,B2,B3有丝分裂有丝分裂cyclinAG2/MCDK2cyclinAS期期cyclinEG1/SCDK3？G1/S?CDK4/6cyclinD1,D2,D3G1期期三、泛素与三、泛素与APC泛素泛素（ubiquitin)组成和分布：组成和分布：由由76个氨基酸组成，高度保守，普遍个氨基酸组成，高度保守，普遍存

11、在于真核细胞，故名泛素；存在于真核细胞，故名泛素；作用：作用：共价结合泛素的蛋白质能被共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体蛋白酶体识别和降解，识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。些异常蛋白降解的普遍途径。把泛素加到周期蛋白或其他蛋白需要把泛素加到周期蛋白或其他蛋白需要3个酶个酶:泛素激活酶泛素激活酶(E1):泛素泛素-COS-Cys-E1(活化活化)泛素结合酶泛素结合酶(E2):泛素泛素-COS-Cys-E2(转硫酯）转硫酯）泛素连接酶泛素连接酶(E3):泛素泛素-CONH-Lys-底物蛋白底物蛋白(标记标记)泛素与被选择降解的蛋白质形成共价连接，

12、使后者标泛素与被选择降解的蛋白质形成共价连接，使后者标记并被激活，称为记并被激活，称为泛素化。泛素化。蛋白酶体蛋白酶体可迅速将可迅速将泛素化泛素化的底物蛋白降解的底物蛋白降解 后期促进复合体（后期促进复合体（anaphasepromotingcomplex，APC）就是一种）就是一种E3,可将泛素连到可将泛素连到M期周期蛋白上期周期蛋白上作用机制：作用机制：分裂期周期蛋白分裂期周期蛋白B的的N端有一段序列与其降端有一段序列与其降解有关，称解有关，称破坏作用盒破坏作用盒(destructionbox)；APC使使E2-泛素复合体找到泛素复合体找到破坏作用盒破坏作用盒，并，并将泛素转移到位于将泛素

13、转移到位于盒盒C端的端的Lys残基残基；泛素化泛素化-多泛素化多泛素化共价结合一串泛素的过程，称为共价结合一串泛素的过程，称为多泛素化多泛素化(polyubiquitination)。周期蛋白周期蛋白B被蛋白酶体识别而降解被蛋白酶体识别而降解周期蛋白周期蛋白B(cyclin B)如何降解？如何降解？细胞周期蛋白的破坏作用盒与降解途径细胞周期蛋白的破坏作用盒与降解途径其他蛋白的降解其他蛋白的降解 G1期周期蛋白期周期蛋白也通过类似的途径降解，但也通过类似的途径降解，但其其N端没有破环作用盒，端没有破环作用盒，C端有一段端有一段PEST序列与其降解有关。序列与其降解有关。PEST序列：指富含脯氨酸

14、（序列：指富含脯氨酸（P)、谷氨酸、谷氨酸（E)、天冬氨酸、丝氨酸（、天冬氨酸、丝氨酸（S)和苏氨酸（和苏氨酸（T)的残基序列的残基序列 缺氧诱导因子缺氧诱导因子-1(Hypoxiainduciblefactor1，HIF-1)Expression and activation of HIF-1 are regulated by the oxygen concentration *Under normoxic conditions:hydroxylation interaction with von Hippel-Lindau (pVHL)pVHL is an important compon

15、ent of the E3 ubiquitin ligase complex.ubiquitinization and degradation *Under hypoxic conditions:Inhibition of hydroxylation Suppression of degradation accumulationHypoxia inducible factor 1 (HIF-1)四、生长因子四、生长因子(growth factor)生长因子生长因子是一大类与细胞增殖有关的信号物是一大类与细胞增殖有关的信号物质，目前发现的生长因子多达几十种；质，目前发现的生长因子多达几十种；多数

16、有促进细胞增殖的功能，故又称多数有促进细胞增殖的功能，故又称有丝分有丝分裂原（裂原（mitogen），），如表皮生长因子如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（）、神经生长因子（NGF）等；）等；少数具有抑制作用（或称生长抑制因子）少数具有抑制作用（或称生长抑制因子）如抑素如抑素(chalone)、肿瘤坏死因子（、肿瘤坏死因子（TNF）、）、c-mos原癌基因产物、原癌基因产物、p39mos(Mos)。生长因子的作用机理生长因子的作用机理五、周期蛋白五、周期蛋白-激酶抑制因子激酶抑制因子（CDK-kinase inhibitor，CKI）CKI对细胞周期起负调控作用对细胞周期起负调控作用 CKI分为两大家族：分为两大家族：INK4(Inhibitor of kinase 4)家族家族 CIP/KIP 家族家族 CIP:CDK inhibitory protein KIP:Kinase inhibitory protein一、一、INK4家族的家族的CKI 包括：包括：P16(INK4a)、P15(INK4b)、P18(INK4c)、P19(INK4d)共同结构：共同结构：4个锚（个锚（