2023基于胎儿游离DNA的产前检测失败因素的研究进展.docx

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1、2023基于胎儿游离DNA的产前检测失败因素的研究进展摘要本文介绍了基于胎儿游离DNA(cell-freefetalDNA,cffDNA)的产前检测失败发生率和原因，以及检测失败后的应对措施。根据检测平台的不同，基于CffDNA的产前检测失败率也存在差异,一般为0.12%8.09%,其中大规模平行测序的失败率最低。造成检测失败的原因主要有三：一是CffDNA浓度低于4%,属于最常见的原因；二是实验室检测过程中DNA提取、文库构建、测序、分析失败；三是检测前血液采集和样本运送到实验室出现的问题。在检测前应充分告知孕妇基于CffDNA的产前检测失败的可能性及相关风险，检测失败后为孕妇综合评估检测失

2、败的原因及重复检测的可行性，制定个体化的产前遗传学检测方案。这对于缓解孕妇面临重复检测的焦虑或决定是否选择介入性产前诊断具有重要的临床意义。【关键词】非侵入性产前检测；游离核酸；产前诊断1997年，L。等1利用敏感的胎儿特异性Y染色体序列-聚合酶链反应技术在孕有男性胎儿的孕妇外周血分离的血浆和血清中检测到Y染色体性别决定区的特异性序列，确定孕妇外周血存在胎儿游离DNA(cell-freefetalDNA,cffDNAXCffDNA少部分来自于胎儿凋亡细胞，大部分来自胎盘合体滋养层凋亡细胞21CffDNA占孕妇游离DNA总量的5%20%,最早可在孕45周时检测到,含量随孕周增大而增加。由于Cff

3、DNA在胎儿娩出后迅速降解，产后孕妇外周血不存在上一胎的CffDNA,故CffDNA可应用于产前检测，不受前次妊娠的影响3-4oC仟DNA的发现推动了孕妇外周血基于CffDNA的产前检测技术发展，即基于CffDNA的产前检测在临床可用于胎儿染色体非整倍体及微缺失、微重复综合征的筛查5-6基于CffDNA的产前检测能够提高筛查效率，减少介入性产前诊断及其相关并发症7然而，由于该检测技术依赖于胎盘来源的CffDNA,受CffDNA含量、母体因素和实验室检测技术等因素影响，存在检测失败的可能8-9I现就该检测失败的原因及发生率，以及检测失败后的应对措施的研究进展综述如下。一、基于CffDNA的产前检

4、测失败的发生率从首次血液样本采集到检测的全流程都应该实行严格的质量控制。ffi11J-个环节失控，都可能导致检测失败。孕妇血液样本采集及处理过程中抗凝管（齐!J）使用不正确、采血量不足、严重溶血或有血凝块、采血管破裂及开盖、标本未按照规定保存及运输、受检者采血时状态等不符合基于CffDNA的产前检测要求导致样本不合格，以及实验操作人员、关键仪器及试剂状态异常，均可造成检测失败10L孕妇外周血总游离DNA提取浓度、文库构建、测序和生物信息学分析等实验过程指标不符合质量控制要求，也可能造成检测失败。应该注意的是，不同的检测平台质量控制的数值可能不同10-130目前文献报告的基于CffDNA的产前检

5、测失败指孕妇首次采血不能获得有效报告的检测失败，以及需要再次采血后最终检测失败，即重采血检测失败8o基于不同检测平台、检测样本量或对检测失败的定义计算得到的失败率差异较大，一般为0.8%12.2%14Gil等14在有关基于CffDNA的产前检测的meta分析中总结了不同原因的检测失败率，其中与血液采集和样本运输有关的失败率为093%-11.1%,与检测分析异常有关的失败率为0%12.2%,与CffDNA含量低有关的失败率为0.5%6.1%。不同基于CffDNA的产前检测平台的检测失败率一般在12.2%以内8OYarOn算8汇总的大规模平行测序平台失败率为0.12%3.81%,靶向测序平台失败率

6、为2.86%-4.88%,单核昔酸多态性微阵列技术平台失败率为6.34%8.09%基于大规模平行测序的方法的失败率最低(1.58%),而基于单核昔酸多态性分析的方法的失败率最高(6.39%X国内一项研究发现，首次采血检测失败率为0.5%(32/5898);在重新采血的30例中，24例在二次采血后发放了检测报告，最终失败率为0.1%(8/5898);而同一检测平台另一项大样本(31832例)基于CffDNA的产前检测中，首次检测失败率为0.628%,最终失败率为0.088%12-13二、基于CffDNA的产前检测失败的原因(一)孕妇外周血CffDNA浓度低孕妇外周血中混合了孕妇游离DNA和Cff

7、DNA0CffDNA是否能准确检测胎儿染色体异常主要取决于CffDNA占孕妇外周血总游离DNA的比例，即CffDNA浓度15OT殳质量控制要求孕妇外周血CffDNA浓度不得低于4%,以保证检测样本中存在足够数量的胎儿DNA,才能正确地解释测序结果16.据估计，孕1020周有2%孕妇的CffDNA浓度低于4%,而同时期有1%3%孕妇的CffDNA浓度低于4%;CffDNA浓度越低,检测失败率越高17-20CffDNA浓度低是检测失败最常见的原因，约50%的检测失败由此引起21主要原因如下。1孕妇肥胖：孕妇体重、体重指数（bodymassindex,BMI）与孕妇外周血CffDNA浓度呈负相关，孕

8、妇肥胖是CffDNA浓度低的常见原因22-23肥胖孕妇的脂肪组织坏死和凋亡增加使孕妇自身游离DNA增加，加之总血容量增加形成的稀释效应,台盘来源的CffDNA相对降低24sYared等25报道，肥胖女性的基于CffDNA的产前检测失败率（243%）明显高于非肥胖女性（3.7%）；随着BMI的增加，失败率明显增加。当BMl为2829.9kgm2时,失败率为7.1%;当BMI为40kgm2时，失败率为50.0%o2.孕周小：Wang等19发现，胎龄与孕妇外周血CffDNA浓度呈正相关成正比孕妇外周血CffDNA浓度中位数在孕10周10周+6为10.2%,孕1021周每周增加0.1%,而孕21周后每

9、周增加1%;孕1021周有2%的CffDNA浓度小于4%,从而导致检测失败。3孕妇患自身免疫性疾病：HUi等26报道了1例患有免疫性血小板减少症和抗磷脂综合征的孕妇进行基于CffDNA的产前检测多次失败，3次采血CffDNA浓度均低于4%0研究发现，有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化、炎症性肠病等自身免疫性疾病的孕妇外周血CffDNA浓度明显低于无此类疾病者，患自身免疫性疾病的孕妇的CffDNA浓度低于4%的比例也更高27L4双胎妊娠：单绒毛膜双胎为同卵双胎，2个胎儿为母体循环提供了相同的CffDNA等位基因，CffDNA分析方法与单胎妊娠相似，而双绒毛膜双胎通常是异卵的。为确保孕妇外

10、周血CffDNA总量足够分析，但考虑到异常胎儿CffDNA浓度低于4%会造成假阴性结果，故确定双绒毛膜异卵双胎CffDNA浓度应取决于双胎中最低的CffDNA浓度280一项前瞻性研究比较了双胎和单胎妊娠的CffDNA浓度分布和失败率，结果发现，双胎妊娠CffDNA浓度中位数低于单胎，而双胎基于CffDNA的产前检测失败率是单胎的3倍290（二）孕妇患肿瘤癌症患者的血清中可检测到肿瘤DNA0受此启发，L0等1和Dharajiya等30发现孕妇外周血CffDNA,因此患肿瘤孕妇的外周血游离DNA包含有孕妇凋亡细胞DNA、肿瘤DNA和CffDNA。Lo窜1诉口Dharajiya等30报道了18例患恶

11、性肿瘤和20例患子宫肌瘤孕妇的基于CffDNA的产前检测失败，分析测序数据发现多条染色体的Z分数升高或降低，属于染色体数据波动30oSuzumori等31发现因Z分数异常检测失败的肿瘤孕妇存在多条染色体数据波动和特定染色体数据波动。染色体数据波动相当于基于CffDNA的产前检测的Z分数处于临界风险或灰区，确立染色体数据波动的Z分数界值与实验室和检测技术平台不同有关12L（三）孕妇使用肝素或阿司匹林在一项回顾性队列研究中，46例检测失败的孕妇中有13例服用了阿司匹林类药物，7例使用了肝素321Gromminger等33发现，服用低分子肝素的孕妇样本测序有效序列中鸟噫吟（guanine,G）和胞嚏

12、碇（cytosine,C）碱基对所占的比率（GC含量）较高，影响18号、21号染色体的Z分数，导致基于CffDNA的产前检测失败331Burns等34也证实肝素可影响基于CffDNA的产前检测，推测其机制可能是肝素减少滋养细胞凋亡并提高滋养细胞存活率的过程中使CffDNA浓度降低,这与Grdmminger等33研究发现应用低分子肝素的孕妇外周血总游离DNA和CffDNA含量较高的结论不尽一致，可能与研究中肝素的种类和使用方法不同有关，需要深入研究其内在机制34Jo总之，肝素和阿司匹林等抗凝剂与基于CffDNA的产前检测失败的相关性已得到证实。（四）溶血溶血是指红细胞破坏后，血红蛋白和其他细胞内

13、成分释放到血液中。溶血的标本离心后根据游离血红蛋白的含量可呈现不同程度的红色35L常规的实验室检测中，因溶血对结果的干扰和影响，实验室可能拒绝接收样本36I一项大规模平行测序平台的基于CffDNA的产前检测研究中分析了有肉眼可见的溶血差异及不同血浆中游离血红蛋白浓度的孕妇外周血，发现轻度或中度溶血对基于CffDNA的产前检测的质量控制指标没有影响，而严重溶血严重影响文库浓度、CffDNA浓度和测序重复率，可造成基于CffDNA的产前检测失败351（五）不明确的性染色体异常基于CffDNA的产前检测出现的无法鉴别的性染色体异常可能是胎儿性染色体异常，也可能是孕妇染色体异常12Bianchi等37

14、在一项前瞻性盲法研究大规模平行测序筛查性能中报告了49例性染色体异常无法正确分类判读造成基于CffDNA的产前检测失败。三、基于CffDNA的产前检测失败的应对措施基于CffDNA的产前检测前后都应做好遗传咨询。在检测前应充分告知孕妇基于CffDNA的产前检测失败的可能性及相关风险，检测失败后应当为孕妇综合评估检测失败的原因及重复检测的可行性，针对不同孕妇制定个体化的产前遗传学检测方案。这对于缓解孕妇面临重复检测的焦虑或决定是否行介入性产前诊断具有重要的临床意义。从卫生经济学角度出发，首次检测失败的孕妇重新采血再次检测会增加实验室的检测成本，但会减少不必要的介入性产前诊断。根据前文所述的检测失

15、败原因，在详细的遗传咨询和充分做好孕妇知情的前提下，可对部分孕妇重采血检测9对肉眼可见的血容量不足、溶血等样本不合格的情况，重采血获得满意标本后即可继续检测。而对于因基于CffDNA的浓度低导致的检测失败，要充分考虑可能原因，排除超声异常后，可对孕周尚小的孕妇重采血再检测13,38对于因使用抗凝药物导致检测失败的孕妇，需要选择适当的重采血时机，以消除抗凝药物对基于CffDNA的产前检测的影响，临床上给药间隔结束时（血浆药物浓度最低时）采集血液33研究发现，使用免疫调节剂治疗自身免疫性疾病时，孕妇基于CffDNA的产前检测失败率低于未治疗组，而未治疗组孕妇重复检测的失败率较高，这提示患有自身免疫

16、性孕妇接受规范治疗可降低CffDNA产前检测失败率271有学者发现对于Z值处于灰区的样本进行实验室重建库重复检测后，95.56%的样本取得了有效低风险结果，多数不需再次采血91孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查实验室技术专家共识明确列出了分析质控不合格时需要重新进行的实验步骤，建立了相对完善的质量控制工作流程，但在实际应用过程中要充分考虑重复检测的效益,以有利于患者为原则，做出后续处理10,381美国妇产科医师学会建议初次基于CffDNA的产前检测失败（包括结果未报告、不确定、无法解释）的孕妇接受遗传咨询，并提供全面的超声评估和诊断检测，但不排除重复进行基于CffDNA的产前检测39L相反地，美国