梅毒的实验室诊断.ppt

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1、梅毒的实验室诊断梅毒的实验室诊断2011.8.31梅毒的实验室诊断 梅毒（Syphilis）是由苍白螺旋体（Treponema Pallidum TP）感染引起的一种慢性性传播疾病，本病表现复杂、病期长，几乎可侵犯全身各个器官，发展过程时隐时现，症状和体征呈多样化，自然感染过程（不治疗）可产生不同临床症状的一期、二期、三期梅毒。2011.8.31病原体n梅毒螺旋体特点1.小而细螺旋状，长614um,直径0.250.3um.有814规则、紧密螺旋。2.透明不容易着色.3.微需氧（13）,人工培养不生长。4.繁殖方式为裂殖.5.对热敏感，骤冷超低温保存数年，复活后接种动物其毒性、活力、形态不变。2

2、011.8.31致病机理n梅毒螺旋体破损皮肤及粘膜感染 24周潜伏感染局部螺旋体大量繁殖硬下疳 经38周 症状自行消失 TP附近淋巴结 血液播散 全身组织和器官 二期梅毒 三期梅毒 心血管、神经等损害。2011.8.31传播途径 性传播：性接触n是主要的传染途径n未经治疗的患者在感染后的1年内最具有传染性。n随着病期的延长，传染性越来越小。n到感染后4年，通过性接触一般无传染性。2011.8.31传播途径 垂直传播：胎传n在妊娠任何阶段，梅毒螺旋体均可通过胎盘传染。n病期越长，传染性越小。n早期梅毒的母亲，发生流产、死产、胎儿先天梅毒或新生儿死亡率高于晚期梅毒的母亲。2011.8.31传播途径

3、间接传播：n污染物、输血。2011.8.31各期梅毒标本采集及检查方法 临床症状 取材部位 检查方法n一期梅毒 硬下疳、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查n二期梅毒 皮损、淋巴结 暗视野检查 血液 血清学检查n隐性梅毒 血液 血清学检查n三期梅毒 血液 血清学检查n神经梅毒 血液、脑脊液 血清学检查2011.8.31梅毒实验室诊断方法梅毒病原体检查血清学检查暗视野检查法镀银染色法直接免疫荧光法确证试验:FTA-ABS、TPHA、TPPA、TP-ELISA、TP-RT 19S-IgM初筛试验：VDRL、USRRPR、TRUST2011.8.31梅毒实验室诊断方法病原体（梅毒螺旋体）检查：一、暗

4、视野检查 二、直接荧光抗体检查 三、涂片染色检查法：镀银染色、吉姆萨染色、墨汁负染色。2011.8.31病原体检查法n 一、暗视野检查法n 原理一期梅毒硬下疳、肿大淋巴结的淋巴液。二期梅毒皮肤粘膜损害、扁平疣、梅毒疹。梅毒孕妇羊水(7周)以上标本均有梅毒螺旋体存在，此时用暗视野显微镜检查能找到梅毒螺旋体。2011.8.31病原体检查法 检查方法检查方法n1、皮损取材：在载玻片加一滴生理盐水，用棉拭子蘸取无菌生理盐水抹去皮损（硬下疳、溃疡、梅毒疹、扁平疣）表面污物，挤压皮损周围，用钝刀刮取组织液混入载玻片盐水中，加盖玻片后暗视野镜检。n2、肿大淋巴结取材：酒精消毒淋巴结表面，用1ml无菌注射器配

5、12号针头，吸取无菌生理盐水0.25-0.5ml,无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水，再吸入注射器内，如此反复2-3次，取少量淋巴液于载玻片上，加盖玻片后暗视野镜检。2011.8.31病原体检查法n3、羊膜穿刺：梅毒孕妇的羊膜穿刺由专职人员操作，将取得的羊水直接滴于载玻片上加盖玻片暗视野镜检。2011.8.31病原体检查法n 结果 暗视野镜检可观察到特征性的梅毒螺旋体。螺旋整齐，数目固定（814）。白色透明折光性强。特征性运动方式：旋转运动、伸缩移行、弯曲前行。2011.8.31暗视野显微镜法直接镜检图像（暗视野显微镜法直接镜检图像（1000）2011.8.31病原体检查法n 临床意义 、暗视野检查

6、可作为梅毒诊断的确证试验，若发现有梅毒螺旋体，即可确诊为梅毒感染。、此法特别适用于血清学试验阴性的早期梅毒诊断，尤其对早期有硬下疳，但梅毒血清反应尚未呈阳性者意义更大。3、暗视野检查是目前快速诊断先天性梅毒可靠的检查方法。2011.8.31病原体检查法n注意事项 1、取材前，要清洁皮损表面的污物。2、应多取组织液提高阳性率，但要尽量避免出血。3、取材后立即观察，以免影响活力 4、注意梅毒螺旋体的特征及运动方式，以鉴别其它螺旋体。5、口腔中存在其他螺旋体，不推荐用于口腔皮损检查。2011.8.31病原体检查法 6、阴性结果不能排除梅毒，应稍后复查或做 血清学检查。原因可能是：螺旋体数量不足 已用

7、过抗生素或某些外用药 损害接近自然消退2011.8.31病原体检查法n二.直接免疫荧光试验（DFA）TP-Ag（标本）TPMcAb-FITC37 x30分TPAg-Ab-FITC 洗涤封片荧光镜检莱果绿色梅毒螺旋体2011.8.31直接免疫荧光法镜检图像（直接免疫荧光法镜检图像（1000）2011.8.31病原体检查法方法学评价：nDFA法特异性及敏感性均大于暗视野显微镜 检测。n可区分梅毒螺旋体与非致病性螺旋体，可适 用于口、肛周等部位的损害。n可因取材、荧光素、抗体质量及操作技术等 因素而致假阴性。2011.8.31病原体检查法n三.镀银染色法标本涂片（TP）自然干燥固定、媒染 洗涤银氨液

8、染色封片镜检可见棕褐色梅毒螺旋体2011.8.31病原体检查法 观察有无染成棕褐色的梅毒螺旋体。n染色阳性，又有典型皮损可确诊。n染色阴性，不能完全排除梅毒。n某些腐生螺旋体可导致假阳性结果。2011.8.31病原体检查法n常见病原体检查方法比较方法 评价暗视野检查特异性高，可作梅毒确证试验，需较高技术及暗视野显微镜。DFA可区分梅毒螺旋体和非梅毒螺旋 体，对试剂要求较高，需荧光显微镜。镀银染色法染色技术要求较高，银氨液配制非常关键，标本可长期保存。2011.8.31梅毒血清学试验 根据抗体的特性和反应性质梅毒血清学试验分为：非梅毒螺旋体血清试验(初筛试验)梅毒螺旋体血清试验(确证试验)201

9、1.8.31梅毒血清学试验-非梅毒螺旋体血清试验n抗原：心磷脂、卵磷脂、胆固醇混合物。方法有：性病研究实验室试验(VDRL)加热血清反应素试验(USR)不加热血清反应素环状卡片实验(RPR)甲苯胺红不加热血清反应素试验(TRUST)2011.8.31梅毒血清学试验-梅毒螺旋体抗原血清试验梅毒螺旋体抗原血清试验n抗原：梅毒螺旋体 目前常用方法有：1.梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)2.梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(TPPA)3.荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）4.梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）5.梅毒螺旋体快速诊断试验（TP-RT）其他方法:梅毒螺旋体19S-IgM抗

10、体测定试验 梅毒螺旋体抗体试验（化学发光法）2011.8.31非梅毒螺旋体血清试验-TRUSTn原理 VDRL-甲苯胺红Ab（血清）红色凝集物（肉眼观察）n 方法 定性 定量血清 原血清 1：2 1：4 1：8 50 50 50 50抗原 1滴 1滴 1滴 1滴(1618ul)混匀，旋转式摇床（100转分）转动分钟，立 即观察结果。2011.8.31非梅毒螺旋体血清试验-TRUSTn结果 定性试验 阳性：出现由小至大的红色絮状物（14）。阴性：颗粒均匀、细小、不出现凝集。定量试验 以出现阳性反应的最高稀释度作为最终滴度。2011.8.31TRUST凝集图像2011.8.31非梅毒螺旋体血清试验

11、-TRUSTn临床意义 1.非特异性反应的初筛试验，可用作疗效观察、判愈、复发或再感染指征。2.初筛试验阳性可表示：现症感染患者 接受治疗近期患者 生物学假阳性者2011.8.31非梅毒螺旋体血清试验-TRUSTn注意事项 1.试剂保存，不能以下冰冻。2.实验环境以2329 为宜，用前试剂恢复室 温。3.试剂在效期内使用，怀疑试剂失效，需用试 剂阴、阳对照及已知阴、阳标本对照。4.用旋转式摇床，不能用平衡式振荡仪。5.试验要用纯血清，以防假阴性。6.血清加抗原后要充分混匀分开。2011.8.31非梅毒螺旋体血清试验-TRUST 7.试验完毕立即观察结果，否则影响结果准确性。8.定性阳性者，确诊

12、治疗前应作定量试验，一是可以了解患者抗体滴度，便于复查作比较，以判断疗效和预后观察；二可以避免“前带现象”。9.初筛试验阳性，应做确证试验以排除生物学假阳性。10.AIDS合并感染梅毒，梅毒血清可阴性，应作暗视野检查螺旋体，同时做HIV检查。2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-TPPAn一、TPPA(梅毒螺旋体明胶凝集试验)n 原理 TP-Ag（明胶颗粒）Ab（血清）洋红 色凝集（肉眼观察）2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-TPPAn方法 定性、定量试验孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 血清稀释液 100 25 25 25 25 25 25 25 血清标本 25 25 25 25 2

13、5 25 25 25 25标本稀释度 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640非致敏颗粒 25致敏颗粒 25 25 25 25 25最终滴度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280轻轻振荡混匀，置湿盒内室温（1530 ）小时后观察结果。2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-TPPAn结果 定性试验2+4+：颗粒凝集覆盖整个孔底，边缘粗糙 呈膜状。1+：颗粒凝集呈多边性粗糙大环状。+/-：颗粒浓集于孔底呈小环状：颗粒聚集于孔中央，边缘光滑呈小红点。定量试验 出现阳性反应的最高稀释度作为最终滴度2011.8.31梅毒螺旋体血清

14、试验-TPPA2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-TPPAn临床意义 1.确证试验阳性可诊断梅毒感染，一种是现症感染者，另一种是治愈者。2.由于特异性梅毒螺旋体抗体可终生阳性，因此不能用来作为疗效观察及治愈的判断标准。一般只作定性试验，根据临床需要才做定量试验。2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-TPPAn注意事项1.反应板要清洁干净，遐免假阳性。2.要用U形板不能用V形板，遐免假阴性。3.试剂保存，不能以下冰冻。4.反应温度以1830 为宜，用前试剂恢复至室温。5.试剂要在有效期内使用，不同批号不要混用。6.血清要分纯，不能混有血液有形成分。2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-TPPA

15、 7.如未致敏颗粒出现凝集，应做吸收试验或 改用其它方法。8.对于可疑阳性结果（1：80），建议作连 续观察或暗视野检查。9.AIDS合并感染梅毒，血清学试验可阴 性，应作暗视野检查螺旋体。2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-TPPAn方法学评价：优点：1、试剂稳定，批间差小 2、结果判读清晰明确 3、敏感性和特异性较TPHA进一步提高不足：结果判定主观，较难实现自动化。2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-FTA-ABSn二、荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS)TP-AgTP-Ab（灭活吸收后血清）37 x30分钟TP-Ag-AbPBS洗涤TP-Ag-Ab+IgG-FITC37 x

16、30分钟TP-Ag-Ab-IgG-FITCPBS洗涤、封片、荧光镜检莱果绿色荧光2011.8.31FTA-ABS IgG抗体阳性（抗体阳性（400）2011.8.31FTA-ABS IgM抗体阳性（抗体阳性（400）2011.8.31梅毒螺旋体血清试验-FTA-ABS方法学评价：方法学评价：FTA-ABS是所有螺旋体试验中最敏感的方法，特异性也很高，被认为是检测梅毒的“金标准”，且该试验可分开检测IgM和IgG。但由于该试验需有优质的荧光显微镜和技术熟练的操作人员才能得到准确的结果，故常不被临床实验室作为常规方法开展。2011.8.31梅毒螺旋体血清试验TP-IgMn三、梅毒IgM抗体血清学检测n临床应用 梅毒螺旋体感染人体，机体体液免疫系统最早产生的抗梅毒螺旋体特异性抗体是IgM，然后才是IgG。IgM抗体滴度水平经治疗下降较快并可转阴性。一期梅毒3 个月阴转率100，二期梅毒9个月阴转率100，早期潜伏期梅毒2年阴转率100。2011.8.31梅毒螺旋体血清试验TP-IgMn 因此，未经治疗患者IgM抗体阳性可能是活动性梅毒的表现。另外，由于IgM聚合体分子量较大，是IgG的5倍，