淋洗类化妆品温和性检测：基于体外重组3D表皮模型的组织活力法.docx

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1、ICS71.100.70Y42团体标准T/ZHCAXXX-XXXX淋洗类化妆品温和性检测：基于体外重组3D表皮模型的组织活力法mildnesstestofrinse-offcosmetics-basedonTissueviabilitymethodofInvitroreconstructedskinmodel（征求意见稿）2021 -xx-xx 发布2021-xx-xx实施浙江省健康产品化妆品行业协会发布/i刖三本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意木文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省

2、食品药品检验研究院提出。本文件由浙江省健康产品化妆品行业协会（ZHCA）归口。本文件起草单位：浙江省食品药品检验研究院、广东博溪生物科技有限公司、欧莱雅（中国）有限公司，上海家化联合股份有限公司，爱茉莉太平洋（上海）研发有限公司。本文件主要起草人：何立成、待定。驻留类化妆品温和性检测：基于体外重组3D表皮模型的组织活力法1范围本文件规定了淋洗类化妆品温和性检测的一种体外测试方法。本文件适用于用体外重组3D表皮模型-EPiKUtisRHE模型以及SkinEthiCTMRHE模型对驻留类化妆品进行温和性测试。本文件可作为驻招类化妆品温和性宣称的实验室方法之一。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文

3、中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该H期对应的版本适用于本文件：不注H期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法化妆品安全技术规范2015版3术语及定义下列术语和定义适用于本文件1.1 1淋洗类化妆品rinse-offcosmetics在人体表面（皮肤、毛发、甲、口唇等）使用后及时清洗的化妆品。3.2温和性mildness皮肤长时间接触受试物，未引起可逆性炎性反应。3. 3体外重组3D表皮模型reconstructedhumanskinmodel以人包皮细胞作为种子细胞，经过体外培养，与人表皮组织具有相

4、似结构及功能的三维组织模型。3.4组织活力法reconstructedhumancornea-likeepitheliumtestmethod将受试样品暴露在表皮模型上，接触一定时间后，计算模型的存活率。4试剂和材料4. 1水：符合GB/T6682规定的三级水。5. 2TritonX-100：CAS号:9002-93-1,分析纯。1.2 3异丙醇：CAS号：67-63-0,分析纯。4.4 嘎哇蓝：CAS号：298-93-1,分析纯。4.5 磷酸盐缓冲液(DPBS)：pH7.0pH7.3,不含钙、镁离子。4.6 1.0%TritonX-100溶液：吸取TritonTMX-IOo(4.2)10L,

5、溶于990L水中，配制成体积分数为1.0%的TritOnTMX-100溶液。4.7 MTT溶液：称取唾哇蓝(4.4)20mg,溶于20.OmLDPBS(4.5)中，配制成城量浓度为1mg/mL的MTT溶液，临用现配，避光保存。4.8 8体外重组3D表皮模型试剂盒：EPiKUtisRHE模型及其培养液、SkinEthiCTMRHE模型及其培养液。1. 9死亡组织模型：将体外重组3D表皮模型置于-20C环境下冷冻24h以上。4. 101%样品液：取受试物100L,溶于9900L水中，配制成体积分数为1.0%样品液。5. 117.5%样品液：取受试物75L,溶于925L水中，配制成体积分数为1.0%

6、样品液。4.12尼龙膜：与SkinEthiCTWRHE模型内径相同的尼龙膜。5仪器设备6. 1分析天平：分度值为0.00OlgO5.2 二氧化碳培养箱。5.3 超净工作台。5.4 外置活塞式移液器：100L1,5.5 连续分液器：25mL。5.6 计时器。5.7 微孔板振荡器。5. 8酶标仪。6测试方法5.1 样品干扰试验试验前需对淋洗类化妆品受试样品(以下简称受试样品)进行样品干扰试验，出现6.1.1和6.1.2的情况需增加死亡组织模型对照组，如无6.1.1和6.1.2的情况可直接取受试样品测定。6. 1.1受试样品与MTT有反应取MTT溶液IQmL,加入受试样品液体80L,分别在Oh、lh

7、、2h和3h时观察样品周边溶液颜色变化情况.若溶液颜色发生变化，需增加死亡组织模型对照组。6.1.2受试样品有颜色若受试样品不溶于异丙醇，无需增加死亡组织模型对照组；若受试样品溶于异丙醇，取受试样品80L或固体80mg,溶于2mL异丙醇中，在57Onm波长处测定吸光度(OD值)，若OD值0.15,需增加死亡组织模型对照组。2. 2测试步骤：方法一(EPiKUtisRHE)6. 2.1体外重组3D表皮模型接收和准备收到体外重组3D表皮模型(以下简称模型)试剂盒后，打开外包装，肉眼观察模型与固体培养基接触界面是否有气泡，如发现接触界面有明显气泡，为不合格模型。在超净工作台中将合格的模型转移至含0.

8、9mL培养液的无菌6孔培养板，在温度为37C土1C、二氧化碳体积分数为5%土1%、相对湿度为95%的条件下孵育lh。更换培养液，继续孵育18h后，再次更换培养液。7. 2.2试验分组和加样试验分为阴性对照组（水）、阳性对照组（1.0%TritonTM.100溶液）和受试样品（1%样品液）组，必要时增加死亡组织模型对照组，每组平行使用3个模型。在室温（18C28C）条件下，换液后采用外置活塞式移液器轻轻在模型表面均匀涂抹受试样品80L,在温度为37C土1C、二氧化碳体积分数为5%1%、相对湿度为95%的条件下暴露24h。6.2.3冲洗暴露结束后，采用连续分液器吸取25mLDPBS将模型逐个进行冲

9、洗。8. 2.4甲瓒提取将模型转移至含300LMTT溶液的24孔培养板中，在温度为37C1C、二氧化碳体积分数为5%土1%、相对湿度为95%的条件下孵育3h5min后，转移至新的24孔培养板中，每孔加入2mL异丙醇，用封口膜密封培养板间隙，避免异丙醇挥发。室温条件下，将培养板固定在微孔板振荡器上，振摇2h,提取甲瓒。也可以采取在4C下过夜的提取方法。9. 2.5OD值的测定提取结束后，将提取液混合均匀，转移至96孔培养板中，每个组织模型取2个复孔，200L孔，用异丙醇作为溶剂对照。在57Onm波长处读取吸光度（OD值），计算组织的存活率。10. 3测试步骤：方法二（SkinEthicwRHE）

10、11. 3.1体外重组3D表皮模型接收和准备收到体外重组3D表皮模型（以下简称模型）试剂盒后，打开外包装，肉眼观察模型与固体培养基接触界面是否有气泡，如发现接触界面有明显气泡，为不合格模型。在超净工作台中将合格的模型转移至含IOmL培养液的无菌12孔培养板，在温度为37C土1C、二氧化碳体积分数为5%1%、相对湿度为95%的条件下孵过夜。6.3.2试验分组和加样试验分为空白对照组（不添加）、阳性对照组（1.0%TritonX-100溶液）和受试样品（7.5%样品液）组，必要时增加死亡组织模型对照组，每组平行使用2个模型。在室温（18C28C）条件下，换液后采用外置活塞式移液器轻轻在模型表面均匀

11、涂抹受试样品30L,盖上尼龙膜，在温度为37C土1C、二氧化碳体积分数为5%土1%、相对湿度为95%的条件下暴露18h。12. 3.3冲洗暴露结束后，采用连续分液器吸取25mLDPBS将模型逐个进行冲洗。13. 3.4甲瓒提取将模型转移至含300LMTT溶液的24孔培养板中，在温度为37C土1C、二氧化碳体积分数为5%土1%、相对湿度为95%的条件下孵育3h土5min后，转移至新的24孔培养板中，每孔模型内外各加入750L异丙醇，用封口膜密封培养板间隙，避免异丙醇挥发。室温条件下，将培养板固定在微孔板振荡器上，振摇2h,提取甲瓒。也可以采取在4C下过夜的提取方法。14. 3.5OD值的测定提取

12、结束后，将提取液混合均匀，转移至96孔培养板中，每个组织模型取2个复孔，200L孔，用异丙醇作为溶剂对照。在570nm波长处读取吸光度（OD值），计算组织的存活率。7数据处理7.1 无死亡组织模型对照组的存活率按式（1）计算。存活率（%） =样品ODfg -溶剂ODfS 阴性ODlS .溶剂ODfi100(1)7.2 有死亡组织模型对照组的存活率按式（2）计算。存活率（%）=100传品OD侑-溶剂OD值）-GE亡组织羯品OD值一死亡组织阴性OD值）阴性0D值-溶剂OD值(2)8结果判定8.1 试验成立条件8. 1.1阴性对照组OD值在1.02.5之间。9. 1.2阳性对照组的存活率15%。10

13、. 1.3同一样品复孔间SD值小于18%.8.2 结果评价8.3 2.1温和性：存活率N50%o8.2.2非温和性：存活率50%.9试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容：a）检验依据；b）样品和阳性对照组的信息，包括与试验操作相关的理化性状;c）体外重组3D表皮模型来源等相关信息；d）试验条件和方法，包括试验具体步骤；e）数据处理与结果评价方法；f）试验的H期；g）结论:h）检验者、校核者和技术负责人签字，以及检验单位公章或检验专用章。参考文献1ReconstructedhumanCornea-IikeEpithelium(RhCE)testmethodforidentifyingchemicalsnotrequiringclassificationandlabellingforeyeirritationorseriouseyedamage,GuidelinesfortheTestingofChemicals,Section4HealthEffectsNo.492S.OECD,2019.2化妆品安全技术规范S.国家药品监督管理局,2015:493-495.