ch03细胞工程实验室及常用仪器设备.ppt

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1、Chapter 2Chapter 2细胞工程实验室组成及 无菌操作技术Section 1 Section 1 实实 验验 室室 组成组成细胞工程实验的基本需要细胞工程实验的基本需要实验准备实验准备 包括培养基配制、器皿洗涤、培养基和器皿灭菌等包括培养基配制、器皿洗涤、培养基和器皿灭菌等无菌操作无菌操作控制培养控制培养一、实验室组成一、实验室组成1.基本实验室基本实验室l准备室准备室：准备室的功能就是进行一切与实验：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作，要求宽敞明亮，通风条件好有关的准备工作，要求宽敞明亮，通风条件好u准备工作准备工作器皿的洗涤器皿的洗涤培养基的配制与分装培养基的配制与分

2、装培养基和器皿的灭菌培养基和器皿的灭菌u组成组成洗涤区洗涤区灭菌区灭菌区贮藏区贮藏区培养基配制区培养基配制区l无菌操作室无菌操作室u进行无菌操作，要求封闭性好，干燥清洁，进行无菌操作，要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌状态能较长时间保持无菌状态u组成组成 缓冲准备区缓冲准备区（更换衣帽、拖鞋、洗手等）（更换衣帽、拖鞋、洗手等）接种区接种区（培养材料的无菌操作）（培养材料的无菌操作）无菌操作室功能简单，面积应小，门窗密闭性无菌操作室功能简单，面积应小，门窗密闭性好，以保证其长期处于较好的无菌状态好，以保证其长期处于较好的无菌状态接种室接种室l培养室培养室u对离体材料进行控制条件下的培养对

3、离体材料进行控制条件下的培养u基本要求是能够控制光照和温度，保持相基本要求是能够控制光照和温度，保持相对无菌的状态对无菌的状态温度：温度：25252727（植物），（植物），35353737（动物）（动物）光照强度：光照强度：200020003000 lx3000 lxu配置适宜的培养架配置适宜的培养架u对于某些精细培养类型（如细胞培养和原对于某些精细培养类型（如细胞培养和原生质体培养等），也可采用生质体培养等），也可采用光照培养箱或人光照培养箱或人工气候室工气候室代替培养室代替培养室培养室培养室智能人工气候箱光照培养箱箱2.辅助实验室辅助实验室l细胞学实验室细胞学实验室对培养材料进行细胞学鉴

4、定和研究对培养材料进行细胞学鉴定和研究由由制片室制片室和和显微观察室显微观察室组成组成要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染受潮湿和灰尘污染细胞实验室细胞实验室l生化分析室生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查养物的有效成分随时进行取样检查大型的次生产物生产实验室，还应建立有大型的次生产物生产实验室，还应建立有效物质分离实验室效物质分离实验室3.细胞工程实验室布局细胞工程实验室布局 便于隔

5、离、便于操作、便于灭菌、便于观察便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察可根据细胞工程实验的操作程序安排可根据细胞工程实验的操作程序安排接种室、培养室应放在与外界环境的隔离的接种室、培养室应放在与外界环境的隔离的区域区域灭菌室应与接种室相邻灭菌室应与接种室相邻细胞工程实验室布局示意图细胞工程实验室布局示意图接种室接种室灭菌室灭菌室准备室准备室细胞学细胞学实验室实验室分析室分析室培养室培养室3培养室培养室2培养室培养室1细胞工程实验室细胞工程实验室Section 2 Section 2 仪器设备仪器设备1、基本设备、基本设备天平天平23台不同精度的天平（台不同精度的天平（0.001或或0.0001

6、，0.01或或0.1）冰箱冰箱用于各种维生素和激素类药品及培养基用于各种维生素和激素类药品及培养基母液的保存或某些实验材料的低温处理母液的保存或某些实验材料的低温处理需需12台，有时需用到台，有时需用到超低温冰箱超低温冰箱（80）酸度计酸度计用于测定培养基及其它溶液的用于测定培养基及其它溶液的pHpH一般要求可测定一般要求可测定pHpH范围范围1-141-14之间，精度之间，精度0.010.01即可即可离心机离心机用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取细胞、原生质体等活细胞

7、的分离用细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机低速离心机核酸、蛋白质分离用核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机高速冷冻离心机规模化生产次生产物，还需选择规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统大型离心分离系统加热器加热器用于培养用于培养基的配制基的配制电炉、微波炉电炉、微波炉纯水装置纯水装置离体培养应使用符合试验要求的纯水或蒸馏水离体培养应使用符合试验要求的纯水或蒸馏水蒸馏水器蒸馏水器纯水机纯水机分装设备分装设备用于大型生产实验室培养基的分装用于大型生产实验室培养基的分装蒸馏水器蒸馏水器超纯水机超纯水机2.灭菌设备灭菌设备 高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅手提式手提式立式立式卧式卧式干热消毒柜干

8、热消毒柜（干热灭菌烘箱）（干热灭菌烘箱）过滤灭菌装置过滤灭菌装置喷雾消毒器喷雾消毒器紫外灯紫外灯干热消毒柜干热消毒柜烘箱烘箱3.无菌操作设备无菌操作设备 超净工作台超净工作台（净化工作台）（净化工作台）通过空气过滤去除微生物和灰尘颗粒来达到净通过空气过滤去除微生物和灰尘颗粒来达到净 化目的的装置化目的的装置由鼓风机、滤板、操作台和照明灯等部分组成由鼓风机、滤板、操作台和照明灯等部分组成单人式和双人式单人式和双人式侧流式和平流式侧流式和平流式接种箱接种箱超净工作台接种箱4.培养设备培养设备 u根据需要所选用的不同规格和控制精度的根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于细胞、组织或器官培养的设施和

9、设备用于细胞、组织或器官培养的设施和设备培养架培养架培养箱培养箱摇床（或振荡培养箱）摇床（或振荡培养箱）生物反应器生物反应器光照培养箱箱摇床振荡培养箱生物反应器5.光温控制设备光温控制设备 照度计、时间程序控制器、空调及温度感照度计、时间程序控制器、空调及温度感应器应器照度计照度计温度湿度自动记录仪温度湿度自动记录仪u光学显微镜（光学显微镜（Light microscopy）典型的动植物细胞直径在数十微米，比人眼典型的动植物细胞直径在数十微米，比人眼最小颗粒还小最小颗粒还小5-10倍，只有借助于显微镜才倍，只有借助于显微镜才可以观察到细胞内部结构可以观察到细胞内部结构分辨率分辨率人眼：人眼：R

10、=100m光学显微镜：光学显微镜：R=0.2m6.细胞学相关设备细胞学相关设备 荧光显微镜荧光显微镜（Fluorescence Microscope）利用强烈的经过滤光镜过滤的激发光线，激发标利用强烈的经过滤光镜过滤的激发光线，激发标本产生荧光本产生荧光特点：染色简便，标本呈彩色图案、明亮，灵敏度比特点：染色简便，标本呈彩色图案、明亮，灵敏度比较高较高荧光倒置显荧光倒置显微镜微镜荧光显微镜相差显微镜相差显微镜 细胞各结构的密度不同，通过致密部分的光线细胞各结构的密度不同，通过致密部分的光线速度小，与通过邻近部分的光线产生速度小，与通过邻近部分的光线产生相位偏差相位偏差或或光光程差程差，这种差异

11、是人眼不可分辨出来的，显微镜利，这种差异是人眼不可分辨出来的，显微镜利用光的衍射和干涉特性，把经过不同区域的光线的用光的衍射和干涉特性，把经过不同区域的光线的相差转化为相差转化为振幅差振幅差（明暗差），（明暗差），使细胞各结构之间使细胞各结构之间呈清晰对比。可以观察活细胞，可以在镜下连续拍呈清晰对比。可以观察活细胞，可以在镜下连续拍摄摄相差显微相差显微镜镜体视显微镜及图像分析系统体视显微镜及图像分析系统 体视显微镜是一种可观测到细胞等物体的立体体视显微镜是一种可观测到细胞等物体的立体三维图像的显微镜，可用于组织细胞培养物病理学三维图像的显微镜，可用于组织细胞培养物病理学的研究，并广泛应用于动物

12、学、植物学、地质学等的研究，并广泛应用于动物学、植物学、地质学等体视显微体视显微成像系统成像系统共聚焦激光扫描显微镜共聚焦激光扫描显微镜（Confocal）它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构微细结构的荧光的荧光三维图像三维图像，观察细胞的形态变化，观察细胞的形态变化或生理功能的改变或生理功能的改变 Confocal显微注射系统显微注射系统（Programmable Microin

13、jector）可以将任何类型的分子或者分子结合物注射到细胞可以将任何类型的分子或者分子结合物注射到细胞的细胞质和细胞核中去。例如，的细胞质和细胞核中去。例如，RNA，DNA，蛋白质，蛋白质，抗体，标记染料，人工合成的分子，多肽，以及所有的抗体，标记染料，人工合成的分子，多肽，以及所有的细胞器都可被注射细胞器都可被注射显微注显微注射系统射系统u电子显微镜电子显微镜 电子的波长比光短，因而用电子代替光可电子的波长比光短，因而用电子代替光可以大大提高显微镜的分辨率，电子运动快，波以大大提高显微镜的分辨率，电子运动快，波长较小（如长较小（如10万伏加速的电子，波长为万伏加速的电子，波长为410-3nm

14、）电子显微镜分辨率电子显微镜分辨率210-3m，分辨力比，分辨力比普通光学显微镜高普通光学显微镜高100倍，广泛应用于生物学、倍，广泛应用于生物学、材料学、化学等领域材料学、化学等领域 超微结构超微结构：即亚显微结构，指电镜下可以：即亚显微结构，指电镜下可以观察到的结构，如细胞器等细微结构观察到的结构，如细胞器等细微结构透射电子显微镜（透射电子显微镜（TEM）使用电磁透镜，由精密线圈产生磁场，使用的照明工使用电磁透镜，由精密线圈产生磁场，使用的照明工具是电子束，而光镜使用的是玻璃透镜。透射电子显具是电子束，而光镜使用的是玻璃透镜。透射电子显微镜，需要微镜，需要超薄切片超薄切片（50-100nm

15、），将一个细胞分），将一个细胞分成成100-200块块分辨率：分辨率：0.1nm特点：特点：（1）透射观察，可观察到二维结构）透射观察，可观察到二维结构（2）可以观察到细胞内部的超微结构、局部结构）可以观察到细胞内部的超微结构、局部结构（3）不可以用于观察活细胞（需超薄切片）不可以用于观察活细胞（需超薄切片）超薄切片机超薄切片机 Ultra Microtome透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（SEM）电子束经光镜聚集成极细的电子探针，在样品表面电子束经光镜聚集成极细的电子探针，在样品表面逐线扫描样品，被电子激发产生二次电子，经收集、逐线扫描样品，被电子激发产生二次电子

16、，经收集、转换，放在荧光屏上成像。样品发出电子多的地方，转换，放在荧光屏上成像。样品发出电子多的地方，在屏上相应位置就变亮，反之则暗在屏上相应位置就变亮，反之则暗特点：特点：（1）用于观察细胞及内部的表面结构）用于观察细胞及内部的表面结构（2）立体感强，三维结构）立体感强，三维结构（3）分辨力（）分辨力（2nm）不及透射电镜（）不及透射电镜（0.1nm）高，）高，用于单个细胞或细小的生物样品用于单个细胞或细小的生物样品扫描电子显微镜u流式细胞仪流式细胞仪流式细胞法是让细胞粒子或小颗粒在细小流式细胞法是让细胞粒子或小颗粒在细小液流的带动下逐个通过检测点，在通过检测液流的带动下逐个通过检测点，在通过检测点时受到与液流方向垂直的点时受到与液流方向垂直的UV光或镭射光光或镭射光的的照射，通过检测光信号的改变来测量细胞或照射，通过检测光信号的改变来测量细胞或小颗粒的性质小颗粒的性质 流式细胞仪能对于处在快速直线流动状态流式细胞仪能对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选定量分析和分选 流式细胞仪工作原理流式细胞仪流式细胞仪