13βD葡聚糖的检验与临床.ppt

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1、11,3-D-葡聚糖检验与临床葡聚糖检验与临床2AIDS插管等侵袭性插管等侵袭性治疗治疗肿瘤和免疫肿瘤和免疫抑制治疗抑制治疗骨髓和实体骨髓和实体器官移植器官移植广谱抗生素广谱抗生素治疗治疗 侵袭性真菌感染率上升侵袭性真菌感染率上升3 4真菌感染的危险因素真菌感染的危险因素：n中心静脉插管中心静脉插管n尿道插管尿道插管n广谱抗生素广谱抗生素n气管插管气管插管n腹部外科腹部外科n肠胃外营养肠胃外营养n营养不良营养不良n住院时间住院时间感染之前定殖感染之前定殖5侵袭性真菌感染侵袭性真菌感染n条件致病性真菌条件致病性真菌n念珠菌病念珠菌病n曲霉病曲霉病n隐球菌病隐球菌病n其他其他6诊断方法n影像学影像

2、学n组织病理学组织病理学/细胞学细胞学n培养培养n血清学血清学n分子生物学方法：分子生物学方法：Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）传统的方法传统的方法7真菌病实验室诊断主要内容真菌病实验室诊断主要内容准确、快速检出真菌病原体准确、快速检出真菌病原体n真菌镜检真菌镜检n真菌培养真菌培养n组织病理组织病理n生理生化生理生化n血清学方法血清学方法n分子生物学分子生物学8镜检和培养方法镜检和培养方法n敏感性低敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检尸检证实深部念珠菌感染的病例血培

3、养阴性。证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。n培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难分定植和感染困难n培养时间长培养时间长n有些标本采集困难有些标本采集困难9非培养方法优点非培养方法优点n快速报告结果快速报告结果n敏感性提高敏感性提高n取材简便取材简便n多以真菌在致病状态产生的物质为检多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性测标志物，结果阳性提示有致病性n定量检测可判断感染严重程度及疗效定量检测可判断感染严重程度及疗效评估评估10非培养诊断的方法简介非培养诊断的方法简介n真菌细胞壁成分真菌细胞壁成分n（1-3）-D-葡聚糖检测

4、（葡聚糖检测（G试验）试验）n真菌抗原检查真菌抗原检查n半乳甘露聚糖（半乳甘露聚糖（galactomannan)抗原抗原（GM)n甘露聚糖甘露聚糖(mannan)抗原抗原n隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）n真菌特异的代谢产物真菌特异的代谢产物nD-阿拉伯糖醇阿拉伯糖醇n真菌真菌 DNA 的检测的检测11临床诊断、拟诊的微生物学1 1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养2 2次分离到同种真菌次分离到同种真菌2 BALF2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性3 3 痰液或痰液或BALFB

5、ALF直接镜检发现新生隐球菌直接镜检发现新生隐球菌4 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性5 G5 G实验连续两次阳性实验连续两次阳性6 GM6 GM实验连续两次阳性实验连续两次阳性12侵袭性真菌感染的诊断标准侵袭性真菌感染的诊断标准EORTC/MSG2008修订版修订版n宿主因素宿主因素n临床特征临床特征n病原学病原学n真菌镜检真菌镜检n真菌培养真菌培养n组织病理学检查组织病理学检查n血清学检查方法（间接证据）血清学检查方法（间接证据）nCSF隐球菌抗原阳性隐球菌抗原阳性确诊确诊nGM-test,G-test临床诊断临床诊断Clinical Infec

6、tious Diseases 2008;46Clinical Infectious Diseases 2008;4613（1,3）-D-葡聚糖检测葡聚糖检测14b1,6葡聚糖 磷脂双分子层几丁质麦角固醇b1,3葡聚糖合成酶mannoproteins1,3真菌细胞膜、壁结构真菌细胞膜、壁结构羊毛固醇羊毛固醇C C1414去甲基化酶去甲基化酶1414位还原和位还原和7 78 8位异构酶位异构酶角鲨烯环氧化酶角鲨烯环氧化酶151,3-D-葡聚糖结构葡聚糖结构葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中1,3-D-1,3-D-葡聚糖占真菌壁成分葡聚糖占真菌壁成分50%50%以上，是真菌细胞

7、壁上的特有以上，是真菌细胞壁上的特有成分成分以以1,3-1,3-糖苷键连接的葡萄糖残糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链基骨架作为主链以分支状以分支状1-6-D1-6-D葡萄糖残基作葡萄糖残基作为侧链为侧链161,3-D-葡聚糖特性葡聚糖特性n对热极为稳定，高压对热极为稳定，高压121121并不能使其灭活。在念珠菌并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G G实验灵敏。实验灵敏。n当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，噬、消化等处理后，(1-3)-D-(1-3)-D-葡聚糖可从胞壁中释

8、葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。n在浅部真菌感染中，在浅部真菌感染中，(1-3)-D-(1-3)-D-葡聚糖未被释放出来，葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。故其在体液中的量不增高。n可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡氏肺孢子菌氏肺孢子菌n不可检测隐球菌、接合菌（根霉不可检测隐球菌、接合菌（根霉/毛霉等）毛霉等）17n“G”试验缘何而来？试验缘何而来？18比浊法反应机理

9、比浊法反应机理细菌内毒素细菌内毒素 （1-3）b b-D-GlucanLAL-RM(反应物反应物)因子因子C活化因子活化因子C 因子因子B活化因子活化因子B 活化因子活化因子G 因子因子G 凝固酶原凝固酶原 凝固酶凝固酶 凝固蛋白原凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）定量浊度仪定量浊度仪Turbidimetric technique GEL19分析前注意事项分析前注意事项n采用无热原采血管采用无热原采血管n抽血后抽血后2h内送检内送检n血标本血标本4-8最多存放最多存放48h48hn检测环境应保持清洁检测环境应保持清洁201,3-D-葡聚糖相关影响因素葡聚糖相关影响因素以下情况可出现假阳

10、性：以下情况可出现假阳性：使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；他含有葡聚糖的材料；静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；链球菌血症；链球菌血症；操作者处理标本时存在污染；操作者处理标本时存在污染；使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。可能造成假阳性。211,3-D-葡聚糖检测临床价值葡聚糖检测临床价值n

11、早期诊断：侵袭性早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无真菌感染增多且复杂，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。期诊断。n指导用药：指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有有针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗效高，价格适宜的药物提供准确的依据。效高，价格适宜的药物提供准确的依据。n评价效果：评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测

12、血浆中葡聚应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚糖浓度变化，评价选用药物的有效性。糖浓度变化，评价选用药物的有效性。n监护病程：监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。监护深部真菌感染易感人群的病发状态。n动态观察：动态观察：易感人群，监测临床疗效。易感人群，监测临床疗效。22曲霉菌半乳甘露聚糖（曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay23中性粒细胞减少症患者中性粒细胞减少症患者40例例（发展为曲霉菌病的高危人群）（发展为曲霉菌病的高危人群）该研究选择该研究选择1,3-D-葡聚糖（葡聚糖（B

13、G）和半乳甘露聚糖（）和半乳甘露聚糖（GM）两个指标）两个指标 用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者BG和和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾病两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾病,但但BG可早于可早于GM升高升高.BG和和GM联合检测用于曲霉菌病的诊疗联合检测用于曲霉菌病的诊疗,其特异性和阳性率均为其特异性和阳性率均为100%.例例 1Carmen Pazos,Jose Ponton,etc.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2005n结论：结论：BG和和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患

14、者是否合并真菌感染联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真菌感染,并将并将单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小.1,3-D-葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检测比较：葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检测比较：用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病 24不同患者不同患者BG()and GM()体液变化情况体液变化情况(a)侵袭性曲霉菌病合并急性髓样白血病患者侵袭性曲霉菌病合并急性髓样白血病患者给予两性霉素给予两性霉素B和卡泊芬净用药和卡泊芬净用药 治疗过程中治疗过程中BG和和GM变化情况变化情况25(b)侵袭性曲霉病

15、合并慢性淋巴细胞白血病患者侵袭性曲霉病合并慢性淋巴细胞白血病患者 未使用两性霉素未使用两性霉素B治疗治疗 BG()和和GM()变化情况变化情况26(c)多发性骨髓瘤患者多发性骨髓瘤患者(非侵袭性曲霉病非侵袭性曲霉病)BG结果假阳性结果假阳性BG()和和GM()27(d)Hodgkins 淋巴瘤淋巴瘤(非侵袭性曲霉病非侵袭性曲霉病)患者患者 GM结果假阳性结果假阳性 BG()和和GM()28(e)急性髓样白血病患者急性髓样白血病患者(非侵袭性曲霉病非侵袭性曲霉病)白色念珠菌和光滑念珠菌白色念珠菌和光滑念珠菌 培养阳性培养阳性 BG和和GM结果假阴性结果假阴性 BG()和和GM()29(f)慢性淋

16、巴细胞白血病患者慢性淋巴细胞白血病患者(非侵袭性曲霉病非侵袭性曲霉病)白色念珠菌白色念珠菌 培养阳性培养阳性 BG和和GM结果阴性结果阴性 BG()和和GM()30120名儿童名儿童 7月月8岁岁1,3-D-葡聚糖定量检测结果：葡聚糖定量检测结果：中位数中位数 32 pg/ml 平均值平均值 68128 pg/ml 高值高值 5例例 12岁岁 348 pg/ml 2岁岁 374 pg/ml 14岁岁 491 pg/ml 13岁岁 754 pg/ml 14岁岁 947 pg/ml 94例例(78%)180pg/ml例例 2P.Brian Smith,Daniel K.Benjamin,Jr,etc.CLINICALAND VACCINE IMMUNOLOGY,July2007n结论结论研究数据显示研究数据显示,健康儿童的健康儿童的1,3-D-葡聚糖水平高于健康成人葡聚糖水平高于健康成人.该指标用于儿童感染性疾病的诊断应慎重该指标用于儿童感染性疾病的诊断应慎重,1,3-D-葡聚糖在儿童葡聚糖在儿童群体的正常值区间有待进一步研究群体的正常值区间有待进一步研究.儿童儿童1,3-D-葡聚糖水平研