釉原蛋白基因性别鉴定.ppt
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1、人民卫生出版社口腔生物学第四版以釉原蛋白基因进行性别鉴定人民卫生出版社口腔生物学第四版实验九 以釉原蛋白基因进行性别鉴定实验目的与要求:实验目的与要求:通过此实验学会PCR检测技术,包括DNA提取、分光光度计的使用、引 物设计的原则、PCR扩增的条件设定,以及电泳和测序结果分析等。实验原理:实验原理:针对Amelogenin基因内含子1区X染色体上6bp缺失的特性,采用一对X、Y同源引物扩增,男性个体同时得到X染色体Amelogenin等位基因特异 性段(简称Am X,106 bp或212 bp)和Y染色体Amelogenin等位基因特异 性片段(简称Am Y,112bp或218 bp),分型
2、结果表现出两条谱带;而女 性仅有Am X(106 bp或212 bp),分型表现为一条谱带,因此鉴定性别。实验内容:实验内容:样品采集DNA提取和含量检测PCR扩增凝胶电泳测序结果分析第三节 口腔疾病分子生物学人民卫生出版社口腔生物学第四版实验设备及器材:实验设备及器材:5ml无菌试管(含肝素抗凝剂);PowerPlex M16 system DNA提取试剂盒,Am 基因上游引物和下游引物,2Taq PCR MasterMix;20bp DNA Ladder Marker;DNA片段快速纯化试剂盒。PCR仪,凝胶成像仪,微量紫外分光光度计,电泳仪。实验方法:实验方法:样品采集采集静脉血5ml于
3、无菌抗凝管中DNA 提取和含量检测性别鉴定PCR 扩增、凝胶电泳、纯化测序第三节 口腔疾病分子生物学人民卫生出版社口腔生物学第四版人民卫生出版社口腔生物学第四版n4种dNTP混合物 各200umol/Ln引物 各10100pmoln模板DNA 0.12ugnTaq DNA聚合酶 2.5unMg2+1.5mmol/L人民卫生出版社口腔生物学第四版 人民卫生出版社口腔生物学第四版n1.变性:高温使双链变性:高温使双链DNA解离形成单链解离形成单链(94,30s)。)。n2.退火:低温下,引物与模板退火:低温下,引物与模板DNA互补区互补区结合(结合(55,30s)。)。n3.延伸:中温延伸。延伸:
4、中温延伸。DNA聚合酶催化以引聚合酶催化以引物为起始点的物为起始点的DNA链延伸反应(链延伸反应(7072,3060s)人民卫生出版社口腔生物学第四版紫外分光光度计紫外分光光度计n紫外分光光度计,就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构,其吸收光能量的情况也就不会相同,因此,每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线,可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量。人民卫生出版社口腔生物学第四版凝胶电泳n凝胶电泳的原理比较简单。当一种分子被放置 在电 场当 中时,它们 就会 以一定 的速
5、度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度也就越快,反之则较慢。迁移率不同,其最终分布于不同条带。人民卫生出版社口腔生物学第四版实验方法:实验方法:DNA 提取和含量检测提取和含量检测:抗凝全血2ml+8m冷l蒸馏水混匀后离心弃上清加等体积预冷0.1%Triton-X 100离心,弃上清 加2ml裂解液打碎沉淀 加10%SDS 100l 混匀加10mg/ml蛋白酶K 40l混匀,55 3小时加入6.0mol/L NaCl 0.7ml震荡20秒离心
6、40分钟取上清加2倍体积的无水乙醇混匀呈絮状DNA沉淀挑取沉淀加80%乙醇洗涤沉淀2次加50l TE 溶解DNA 加入200l 5%Chelex-100,2l(10mg/mL)蛋白酶K,震荡10秒摇床150r/min,56恒温孵化12小时,震荡15秒100水浴8分钟,震荡15秒12000r/min 离心5分钟,取上清液紫外分光光度计检测样品在260nm的OD值确定DNA含量第三节 口腔疾病分子生物学人民卫生出版社口腔生物学第四版实验方法:实验方法:性别鉴定性别鉴定PCR 扩增扩增、凝胶电泳、纯化测序、凝胶电泳、纯化测序u PCR 扩增:扩增:PCR反应引物序列如下:上游引物(5-CCCTGG
7、GCT CTG TAA AGA ATA GTG-3),下游引物(5-ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG3);模板DNA为上述血液所获样品的DNA提取液。PCR 反应体系为25L,其中2Taq PCRMasterMix 12.5l,上下游引物(1mol/L)各1l,无菌双蒸水9.5l,模板DNA 1l。u PCR 反应参数反应参数:95预变性5分钟;95变性30秒,60退火30秒,72延伸30秒,35个循环;72延伸7分钟。u 凝胶电泳凝胶电泳:制备浓度为3g/L的琼脂糖凝胶,置1TAE电泳缓冲液中,电泳条件为:电压100V,电泳时间120分钟。电泳结果放入凝胶成像仪



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- 蛋白 基因 性别 鉴定
