第七章++基因治疗.ppt

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1、第七章 基因治疗本章目录本章目录l7.1 7.1 基因治疗的概念与发展基因治疗的概念与发展l7.1.1 7.1.1 基因治疗的概念与策略基因治疗的概念与策略l7.1.2 7.1.2 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序l7.1.3 7.1.3 基因治疗的现状与展望基因治疗的现状与展望l7.2 7.2 基因治疗的载体基因治疗的载体l7.2.1 7.2.1 病毒载体病毒载体l7.2.2 7.2.2 非病毒载体非病毒载体l7.2.3 7.2.3 载体与基因治疗中的靶向性问题载体与基因治疗中的靶向性问题l7.3 7.3 重要疾病的基因治疗重要疾病的基因治疗l7.3.1 7.3.1 遗传病的基因治疗遗传

2、病的基因治疗l7.3.2 7.3.2 肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗l7.3.3 7.3.3 病毒病的基因治疗病毒病的基因治疗 第一节第一节 基因治疗的概念与发展基因治疗的概念与发展 l基因治疗的概念与策略基因治疗的概念与策略l基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序l基因治疗的现状与展望基因治疗的现状与展望一、一、基因治疗的概念基因治疗的概念 基因治疗（基因治疗（gene gene therapytherapy）就是向有就是向有功能缺陷的细胞补充相功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。达到治疗的目的。Gene Thera

3、py Principles基因治疗的前提条件基因治疗的前提条件 l发病机制在发病机制在DNADNA水平上已经清楚水平上已经清楚l要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解解l该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作基因治疗的策略基因治疗的策略 1 1）基因置换基因置换，就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基，就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的因，使细胞内的DNADNA完全恢复正常状态。完全恢复正常状态。2 2）基因修复基因修复，是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部，是指将

4、致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。分予以保留。3 3）基因修饰，又称基因增补基因修饰，又称基因增补。是将目的基因导入病变细胞或其。是将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使他细胞，目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得到加强。原有的某些功能得到加强。4 4）基因失活基因失活，利用反义，利用反义RNARNA、核酶或肽核酸等反义技术及、核酶或肽核酸等反义技术及RNARNA干干涉等技术能特异地封闭基因表达的特性，抑制一些有害基因涉等技术能特异地封闭基因表达的特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。的表达，以达到治疗

5、疾病的目的。5 5）免疫调节免疫调节，这是将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体，这是将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人的免疫状态，从而达到预防和治疗疾病的目的。内，改变病人的免疫状态，从而达到预防和治疗疾病的目的。基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径 1 1）ex vivoex vivo法，法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体内，让外源基因表达以改善患者症状。内，让外源基因表达以改善患者症状。2 2）in vivoin vivo法，法，直

6、接将外源直接将外源DANDAN注射到机体内，使其在体注射到机体内，使其在体内表达发挥治疗作用。内表达发挥治疗作用。in vivoin vivo法比法比ex vivoex vivo法更简单、直接和经济，疗效也比较法更简单、直接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移手段有病毒介导，脂质确切，常用的体内基因直接转移手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。体介导和基因直接注射等。二、基因治疗的基本程序二、基因治疗的基本程序 l基因治疗的主要步骤基因治疗的主要步骤目的基因的克隆目的基因的克隆基因转移系统的建立基因转移系统的建立靶细胞的选择靶细胞的选择基因的导入。基因的导入。1.1.目的基因的

7、选择和制备目的基因的选择和制备 l用于基因治疗的基因必须满足以下条件：用于基因治疗的基因必须满足以下条件：1 1）在体内仅有少量表达就可以显著改善症状；）在体内仅有少量表达就可以显著改善症状；2 2）该基因的过高表达不会对机体造成危害；）该基因的过高表达不会对机体造成危害；3 3）外源基因可有效导入靶细胞）外源基因可有效导入靶细胞4 4）外源基因能在靶细胞中长期稳定存留）外源基因能在靶细胞中长期稳定存留5 5）导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害）导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害 2.2.靶细胞的选择靶细胞的选择 1）生殖细胞l基因的转移只能用显微注射，效率不高，并且只适用于排卵周期短

8、而次数多的动物，不适用于人类。所以，这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展。2）体细胞l采取基因置换、基因修复等方式，但还不能实现特定位点的基因转移。只能采取基因在基因组上非特定定位，随机整合的方式。只要基因能表达产物就可以达到治疗的目的。是一种异常基因功能补偿的基因治疗方式。靶细胞的选择靶细胞的选择 l最好为组织特异性细胞最好为组织特异性细胞l细胞较易获得，且生命周期较长细胞较易获得，且生命周期较长l离体细胞较易受外源基因转化离体细胞较易受外源基因转化l离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活仍较易成活 常用的靶细胞常用的靶细胞l造血细胞

9、造血细胞l皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞l肝细胞肝细胞l血管内皮细胞血管内皮细胞l淋巴细胞淋巴细胞l肌肉细胞肌肉细胞l肿瘤细胞肿瘤细胞3.转移载体的选择与细胞转染l病毒感染、显微注射、电穿孔、化学转染试剂等。病毒感染、显微注射、电穿孔、化学转染试剂等。4.外源基因的表达及检测 第二节第二节 基因治疗的载体基因治疗的载体 l病毒载体病毒载体l非病毒载体非病毒载体l载体与基因治疗中的靶向性问题载体与基因治疗中的靶向性问题一一 、病毒载体、病毒载体l逆转录病毒载体逆转录病毒载体 l腺病毒载体腺病毒载体(AV)(AV)l腺伴随病毒载体（腺伴随病毒载体（AAVAAV）1.逆转录病毒载体逆转录病毒载体 外源

10、目的基因外源目的基因J 优点优点L 缺点缺点2.2.腺病毒载体腺病毒载体(AV)(AV)腺病毒的结构腺病毒的结构 l蛋白质外壳蛋白质外壳包囊外壳蛋白：由纤维状蛋白分子和角蛋白组成包囊外壳蛋白：由纤维状蛋白分子和角蛋白组成 骨架蛋白：起着保持包囊形状的作用骨架蛋白：起着保持包囊形状的作用 DNADNA结合蛋白：与结合蛋白：与DNADNA结合结合 l线性双链双螺旋病毒线性双链双螺旋病毒DNA DNA Adenovirus36 kb Double Stranded DNA GenomeEntry through CAR receptor and integrin co-receptor 腺病毒基因组

11、腺病毒基因组DNADNAl基因组长基因组长36kb36kb，两端各有一个，两端各有一个ITRITR，ITRITR内侧为病毒包装内侧为病毒包装信号。信号。l6 6个早期转录基因：个早期转录基因：E1a,E1bE1a,E1b，E2a,E2bE2a,E2b，E3,E4E3,E4，承担，承担基因调控功能基因调控功能l1 1个晚期转录单元个晚期转录单元(5(5个晚期基因个晚期基因L1-L5)L1-L5)：负责结构蛋白的：负责结构蛋白的编码。编码。lE1E1的缺失可能造成病毒再复制阶段的流产，的缺失可能造成病毒再复制阶段的流产，E3E3为复制非为复制非必须区，可被外源基因替代。必须区，可被外源基因替代。基

12、因组基因组DNADNA长长36kb36kb，两端各有一个两端各有一个ITRITR，ITRITR内侧为病毒包装信号。内侧为病毒包装信号。ITRITRE1E2E3E4IVa2VAL1L2L3L4L5ITRITR是是反向重复序列反向重复序列E1-E4E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的,表达调控有关，其表达调控有关，其中中E3E3编码晚期基因的调控因子编码晚期基因的调控因子 L1-L5L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因为编码病毒包装蛋白的晚期基因IVa2IVa2和和VAVA均为病毒均为病毒RNARNA聚合酶的亚基编码基因。聚合酶的亚基编码

13、基因。腺病毒载体的构建腺病毒载体的构建l第一代腺病毒载体缺少第一代腺病毒载体缺少E1aE1a和和 E1bE1b基因，基因，取代的是治疗基因。取代的是治疗基因。包装细胞基因组含有包装细胞基因组含有E1E1基因；但第一代腺病毒载体产生炎症，基因；但第一代腺病毒载体产生炎症，而且基因表达快速衰退；而且基因表达快速衰退；l第二代腺病毒载体在删除第二代腺病毒载体在删除E1E1的基础上，或者突变的基础上，或者突变E2E2区或直接区或直接除掉除掉E2E2或或E4E4区，区，基因型为基因型为E1E1E2E2或或E1E1E4E4。由于保留有。由于保留有E3E3区，可抑制宿主的免疫反应。区，可抑制宿主的免疫反应。

14、l第三代腺病毒载体正在开发，第三代腺病毒载体正在开发，目的是尽可能多删除全部的反目的是尽可能多删除全部的反式序列基因，以降低病毒基因的表达，但腺病毒载体的生产式序列基因，以降低病毒基因的表达，但腺病毒载体的生产及治疗基因在细胞内的稳定性可能有影响。及治疗基因在细胞内的稳定性可能有影响。E1E3DNAE3DNAE3J 优点优点插入插入DNADNA片段较长片段较长宿主范围广，不需要正在分裂的细胞宿主范围广，不需要正在分裂的细胞不整合，减少插入突变的潜在危险不整合，减少插入突变的潜在危险L 缺点缺点需反复给药需反复给药具有免疫原性具有免疫原性3.3.腺伴随病毒载体（腺伴随病毒载体（AAVAAV）l腺

15、伴随病毒属于细小病毒科，病毒颗粒直径为腺伴随病毒属于细小病毒科，病毒颗粒直径为20nm20nm，无，无包膜，包膜，2020面体。面体。是一类单链线状是一类单链线状DNADNA病毒病毒。AAVAAV感染率很感染率很高，而且尚无发现高，而且尚无发现AAVAAV引起人体疾病的报道，相反，引起人体疾病的报道，相反，AAVAAV感染者减少了患癌的机会。感染者减少了患癌的机会。腺伴随病毒载体的基因组腺伴随病毒载体的基因组lAAVAAV基因组很小，两端也是基因组很小，两端也是ITRITR，中间含有，中间含有3 3个启动子和个启动子和2 2个编码基因（个编码基因（reprep和和capcap）。）。REPRE

16、P参与病毒复制、转录的参与病毒复制、转录的调节，并与基因组的整合有关。而调节，并与基因组的整合有关。而CAPCAP是病毒衣壳蛋白。是病毒衣壳蛋白。lAAVAAV是一种缺陷病毒，只有在与腺病毒等辅助病毒共转是一种缺陷病毒，只有在与腺病毒等辅助病毒共转染时才能进行有效复制和产生溶细胞感染。染时才能进行有效复制和产生溶细胞感染。l在人体，在人体，AAVAAV特异整合到特异整合到1919号染色体上，是唯一一种以位号染色体上，是唯一一种以位点特异性方式整合的真核病毒，从而避免了随机整合而点特异性方式整合的真核病毒，从而避免了随机整合而导致宿主细胞突变的潜在危险性。导致宿主细胞突变的潜在危险性。lAAVAAV载体是缺失病毒结构基因，仅保留两个载体是缺失病毒结构基因，仅保留两个ITRITR。l使用使用AAVAAV载体安全，但缺乏高效的包装细胞。载体安全，但缺乏高效的包装细胞。腺伴随病毒载体构建腺伴随病毒载体构建二二 非病毒载体非病毒载体 1.1.裸露裸露DNA DNA 2.2.脂质体法脂质体法1.1.裸露裸露DNADNA 直接注射直接注射溶液类型对基因表溶液类型对基因表达有影响：达有影响：重组重组D