第7章 种质离体保存.ppt

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1、1第七章第七章种质离体保存种质离体保存概 述低温 保存的 细胞学 基础保存中 遗传变异 的检测与利用影响 保存 效果的 因素超低温保存的 方法2几个相关概念（见几个相关概念（见园艺植物育种学园艺植物育种学）种质（种质（germplasmgermplasm）：）：决定生物的遗传性状，并将遗传信息决定生物的遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质从亲代传递给子代的遗传物质。种质资源包括动植物的。种质资源包括动植物的个体、个体、器官、组织、细胞器官、组织、细胞甚至控制生物遗传性状的甚至控制生物遗传性状的基因。基因。种质库：又称基因库（种质库：又称基因库（GenBankGenBank），是以种

2、为单位的群体中），是以种为单位的群体中的全部遗传物质，它由许多不同基因型的个体所组成。的全部遗传物质，它由许多不同基因型的个体所组成。种质资源（种质资源（germplasmgermplasm resource resource）或遗传资源（）或遗传资源（genetic genetic resourceresource）：具有种质并能繁殖的生物体。）：具有种质并能繁殖的生物体。种质资源保存：为避免种质资源的流失，种质资源保存：为避免种质资源的流失，利用自然或人工创利用自然或人工创造的适宜环境，实现种质材料生活力的长期保持。造的适宜环境，实现种质材料生活力的长期保持。3种质资源保存方法种质资源保存

3、方法就地保存（自然保护区）就地保存（自然保护区）迁地保存（种质圃保存）迁地保存（种质圃保存）种子保存种子保存离体培养保存离体培养保存基因文库保存基因文库保存常温限制生长保存常温限制生长保存中低温调控生长保存中低温调控生长保存低温干燥保存低温干燥保存减压保存减压保存低温保存低温保存（低于（低于-80-80）超低温保存超低温保存（-196-196）难以长期保持种质寿难以长期保持种质寿命，对种质保存的作命，对种质保存的作用不是很大。用不是很大。按保存条件按保存条件（温度、含氧量等）（温度、含氧量等）按材料和方式按材料和方式4第一节第一节 概概 述述一、植物种质资源低温保存的意义一、植物种质资源低温保

4、存的意义防止物种或品种灭绝防止物种或品种灭绝节省人力物力节省人力物力便于种质资源的国内外交流便于种质资源的国内外交流5二、超低温保存的概念二、超低温保存的概念 低温保存（低温保存（cryopreservation）是由是由cryo和和preservation组成，在组成，在英语中英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。看，低温所涉及的温度范围是不确定的。超低温超低温:-80 极低温极低温:-70(干冰温度干冰温度)低温低温:4 6 但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如但对植物

5、而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6.5，枳壳，枳壳通常在通常在-20左右（沈德绪等，左右（沈德绪等，1986）。）。7低温保存低温保存（CryopreservationCryopreservation），是指将植物的组织或），是指将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在低于细胞经过防冻处理后，在低于-80-80条件下保存的方法。条件下保存的方法。超低温保存超低温保存：将植物的组

6、织或细胞经过防冻处理后，在：将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在-196-196的极端低温下保存的方法。的极端低温下保存的方法。8超低温保存的优点超低温保存的优点:在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，完全停止，呈现呈现“假死假死”状态。因此，细胞、组织和器状态。因此，细胞、组织和器官在此过程中官在此过程中不会不会发生遗传性状的改变，也发生遗传性状的改变，也不会不会丢失形丢失形态发生的潜能。态发生的潜能。在在超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，故能够实现故能够实现长时期的

7、保存。长时期的保存。9超低温保存的意义超低温保存的意义:可以在可以在有限空间内保存大量种质材料有限空间内保存大量种质材料；与种子保存相比，与种子保存相比，可以不受时间和种子含水量的制约可以不受时间和种子含水量的制约；与试管苗相比，可以与试管苗相比，可以避免频繁继代培养造成的变异避免频繁继代培养造成的变异，并，并大幅度减少工作量。大幅度减少工作量。10 常用的超低温保存方法：常用的超低温保存方法：冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法 玻璃化处理的超低温保存法玻璃化处理的超低温保存法11三、超低温保存的研究概况三、超低温保存的研究概况1超低温保存技术的发展超低温保存技术

8、的发展2用于超低温保存的植物材料用于超低温保存的植物材料3超低温保存的植物种类超低温保存的植物种类 据王君晖等据王君晖等19981998年统计，有年统计，有4040多个属多个属6060多个种的木本植物已进多个种的木本植物已进行了超低温保存研究，其中：行了超低温保存研究，其中：种子、胚、胚轴和胚的保存一般采用干冻法；种子、胚、胚轴和胚的保存一般采用干冻法；茎尖和分生组织多采用玻璃化法或包埋脱水法；茎尖和分生组织多采用玻璃化法或包埋脱水法；愈伤组织和悬浮细胞大多采用两步法。愈伤组织和悬浮细胞大多采用两步法。1213第二节第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础植物材料超低温冻存的细胞学基础一、细胞内

9、外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键 植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60-90。细。细胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90，很容易，很容易冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水那样在那样在0就结冰。就结冰。141.1.细胞内外水分的冻结特性细胞内外水分的冻结特性理论上讲，细胞外水的冻结温度为理论上讲，细胞外水的冻结温度为-5-5-15-15，细胞内，细胞内游离水的冻结温度

10、为游离水的冻结温度为-25-25，故，故在在-30-30时，细胞内的游离时，细胞内的游离水全部被冻结，而结合水则在水全部被冻结，而结合水则在-100-100温度下也不发生冻结。温度下也不发生冻结。15根据根据LuyetLuyet的冻结理论（的冻结理论（19371937），细胞内游离水的冻结），细胞内游离水的冻结温度（温度（-30-30）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法一般以胞冻存的两步冻结法一般以-30-30为基础的。为基础的。也就是说，也就是说，控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技术的关键。术的关

11、键。16超低温保存的原理超低温保存的原理为什么在为什么在超低温条件下材料不会冻死。超低温条件下材料不会冻死。关键原因是进关键原因是进行了行了“防冻处理防冻处理”，具体如下：具体如下：使用冷冻防护剂可以使用冷冻防护剂可以降低培养基和培养材料的冰点降低培养基和培养材料的冰点。使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发生轻微质壁分离，从而生轻微质壁分离，从而提高了组织和细胞的抗寒能力提高了组织和细胞的抗寒能力。17根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：分步冷冻分步冷冻：在细胞内游离水冻结之前，：在细胞内游

12、离水冻结之前，先使细胞外水分冻结，先使细胞外水分冻结，从从而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致细胞适度脱水细胞适度脱水，利于细胞的冷，利于细胞的冷冻保存。冻保存。快速冷冻：快速冷冻：也称也称玻璃化冷冻保存玻璃化冷冻保存技术，通过迅速降温，使技术，通过迅速降温，使细胞内细胞内水冻结产生的冰晶体积非常小水冻结产生的冰晶体积非常小，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。182.2.低温下细胞的致死损伤低温下细胞的致死损伤超低温保存的一般过程：超低温保存的一般过程：超低温

13、保存是建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上的。超低温保存是建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上的。超低温保存成功的关键，在于降温过程中避免细胞内溶液结冰。超低温保存成功的关键，在于降温过程中避免细胞内溶液结冰。为为此，对于不同的植物种类或材料，应筛选相应的冰冻保护剂，采用此，对于不同的植物种类或材料，应筛选相应的冰冻保护剂，采用适当的降温速度及化冻方式，才能使细胞不受损伤或损伤最小。适当的降温速度及化冻方式，才能使细胞不受损伤或损伤最小。预冻预冻超低温长期保存超低温长期保存解冻解冻19第三节第三节 超低温保存的方法超低温保存的方法 超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰超低温保存的

14、程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评价等步骤。价等步骤。降温冰冻方法降温冰冻方法玻璃化保存方法玻璃化保存方法超低温保存的方法超低温保存的方法20一、传统的降温冰冻方法一、传统的降温冰冻方法1慢冻法：以慢冻法：以0.5-2/min速度降温至速度降温至-100后投入液氮，或以该速度后投入液氮，或以该速度一直降温至一直降温至-196后投入液氮。后投入液氮。在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰晶，又能防止因溶质含量增加引起的晶，又

15、能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应溶液效应”。因此，对于原生。因此，对于原生质质体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好。体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好。212快冻法：快冻法：将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对含水量高的细胞培养物则不适合。含水量高的细胞培养物则不适合。223分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的

16、分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的速度速度(0.5 4/min)降至降至-30-40，停留，停留0.51h，然后直接投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水然后直接投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水分结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均分结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均一性冰晶。一性冰晶。234.干冻法：将样品在高浓度干冻法：将样品在高浓度(0.5-1.5M)渗透性化合物培养基渗透性化合物培养基上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水数小时数小时(使含水量降至使含水量降至1740)或用藻酸盐包埋后投入液或用藻酸盐包埋后投入液氮保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、氮保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料。胚、茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料。24二、玻璃化保存方法二、玻璃化保存方法 玻璃化（玻璃化（vitrificationvitrification）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化过