第5章植物细胞制药一.ppt

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1、第五章第五章植物细胞工程制药植物细胞工程制药植物细胞培养与细胞工程植物细胞培养与细胞工程细胞工程细胞工程应用的原理和方法应用的原理和方法研究的水平研究的水平研究的目的研究的目的细胞生物学和细胞生物学和分子生物学分子生物学细胞整体水平细胞整体水平或细胞器水平或细胞器水平按照人们的意愿来按照人们的意愿来改变细胞内的遗传改变细胞内的遗传物质或获得细胞产物质或获得细胞产品品概念概念分类分类植物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程理论基础理论基础细胞的细胞的全能性全能性细胞的全能性细胞的全能性概念概念大小大小原因原因必要条件必要条件受精卵受精卵生殖细胞生殖细胞体细胞体细胞细胞离体、一定的营养物质

2、、细胞离体、一定的营养物质、激素和其他外界条件激素和其他外界条件基本概念 植物细胞的全能性植物细胞的全能性：植物体中任何一个具有完整：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个性。都可以重新再分化形成原来的个性。植物的植物的分化分化（differentiation）可以分为胚胎发生和器官发）可以分为胚胎发生和器官发生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚进而发育为成熟胚和种子；后者是种子在适宜的条件下胚进而发育为成熟胚和种子；后者是种子在适

3、宜的条件下萌发，形成根、茎、叶、花和果实。萌发，形成根、茎、叶、花和果实。脱分化脱分化（dedifferentiation)：已经分化的细胞、组织和器：已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞组织的过程。官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞组织的过程。再分化再分化（redifferentiation)：通过脱分化诱导形成的愈伤组：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。器官。由体细胞或性细胞通过脱分化形成胚状体；由体细胞或性细胞通过脱分化形成胚状体；这这愈伤组织直接形成胚状体。上

4、述两种途径都可进一步发育愈伤组织直接形成胚状体。上述两种途径都可进一步发育成同母体相同的植株，即植物细胞全能性。成同母体相同的植株，即植物细胞全能性。外植体外植体（explant）：是指用于植物组织（细胞）：是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花等均可作为外植体进行组织培养。药和花等均可作为外植体进行组织培养。无性繁殖系无性繁殖系（clone）又叫克隆，在植物细胞工）又叫克隆，在植物细胞工程中是指使用母体培养物反复进行继代培养时，程中是指使用母

5、体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。代。同一无性系分离出来的两个或多个不同的系列，同一无性系分离出来的两个或多个不同的系列，称为无性系的称为无性系的变异体变异体。植物细胞工程植物细胞工程植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交过程过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽植物体植物体外植体外植体脱分化脱分化植物激素：细胞分裂植物激素：细胞分裂素、生长素素、生长素再分化再分化次级代谢作用和次级代谢产物次级代谢作用和次级代谢产物植物细胞与组织培养植物细胞的结构特征植物细

6、胞的结构特征第四节 植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术MS salts reduced to 0.47 g/L MS salts increased to 9.52 g/L 植物细胞培养基本技术Growth medium is optimized for regeneration of plantletsNo s

7、ucrose(0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术No NAANAA reduced to 0.1 mg/L NAA increased to 5.0 mg/L植物细胞培养基本技术No BAP BAP reduced to 0.1 mg/L 植物组织和细胞培养物的生长过程植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和主要取决于生长素和分裂素的比例。分裂素的比例。高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂；而低浓度高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂；而低浓度生长素和高浓度分裂素

8、则刺激细胞生长。生长素和高浓度分裂素则刺激细胞生长。极个别植物组织含有合成足够和量内源植物激素的能力；极个别植物组织含有合成足够和量内源植物激素的能力；绝大多数植物组织和细胞培养基加入一定量的植物生长绝大多数植物组织和细胞培养基加入一定量的植物生长调节剂。少数培养物在经历了多次继代培养后也可能自调节剂。少数培养物在经历了多次继代培养后也可能自发成长为激素自养型（不稳定表型），此类组织的优点发成长为激素自养型（不稳定表型），此类组织的优点是其生长率高和费用低。是其生长率高和费用低。植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术 植物细胞培养基

9、本技术植物细胞培养基本技术1.固体培养固体培养 包括利用琼脂作为支技物的固体培养和固定化细包括利用琼脂作为支技物的固体培养和固定化细胞培养。胞培养。特点：特点：简便易行、培养所占空间小简便易行、培养所占空间小 缺点：缺点：培养条件不均一，易堆积有害代谢物，难培养条件不均一，易堆积有害代谢物，难以控制和检测以控制和检测 常用固化剂：常用固化剂：琼脂琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶明胶、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。植物细胞培养基本技术植物细胞培养基本技术2.液体培养液体培养 一种外植体经过一定次数的继代培养，待愈伤组织变一种外植

10、体经过一定次数的继代培养，待愈伤组织变得较为疏松时，其培养物就可用于悬浮培养。得较为疏松时，其培养物就可用于悬浮培养。液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振荡两类。荡两类。静止培养简便易行，而且不会出现营养物质浓度差的静止培养简便易行，而且不会出现营养物质浓度差的现象。现象。振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，利用振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，利用磁力搅拌或摇床在不断振（摇）动的情况下进行培养，磁力搅拌或摇床在不断振（摇）动的情况下

11、进行培养，此法可克服静止培养的许多缺点。此法可克服静止培养的许多缺点。植物细胞培养基本技术1.成批培养法成批培养法将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。最适于植物细胞培养的生物反应器当属最适于植物细胞培养的生物反应器当属气升式气升式反应器反应器，它用通气代替搅拌，避免了使用机械，它用通气代替搅拌，避免了使用机械搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易污染等缺点。污染等缺点。植物细胞两步培养法：第一个反应器用于细胞植物细胞两步培养法

12、：第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。物的生产。（实例：紫草宁）（实例：紫草宁）植物细胞培养基本技术 2.半连续培养法半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。培养方法称为半连续培养法。通过调整收获细胞的数量和次数来保持通过调整收获细胞的数量和次数来保持细胞重量的恒定细胞重量的恒定。实例：实例：烟草细胞培养烟草细胞培养植物细胞培养基本技术 植物细胞悬浮培养反应器植物细胞悬浮培养反应器（搅

13、拌式）（搅拌式）3.连续培养法连续培养法 利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。=maxmax S/S/（K Ks s+S+S）连续培养法培养时间长，其细胞的生产能力比较高，但连续培养法培养时间长，其细胞的生产能力比较高，但技术条件要求较为苛刻。技术条件要求较为苛刻。在培养特定细胞或生产次级代谢产物时，又应用了二阶在培养特定细胞或生产次级代谢产物时，又

14、应用了二阶段连续培养法段连续培养法第一罐投入生长培养基进行连续培养，第一罐投入生长培养基进行连续培养，第二罐第二罐投入生产培养基进行连续培养，两罐间连通管道投入生产培养基进行连续培养，两罐间连通管道连接。连接。实例：实例：生物烟草细胞生物烟草细胞植物细胞培养基本技术 4.固定化培养法固定化培养法植物细胞固定化培养技术，可使细胞块中各个植物细胞固定化培养技术，可使细胞块中各个细胞处于一定理化梯度下，与完整植株类似，细胞处于一定理化梯度下，与完整植株类似，是目前相对优化的培养方法。是目前相对优化的培养方法。固定化反应器：网状多孔板、尼龙网套、中孔固定化反应器：网状多孔板、尼龙网套、中孔纤维膜等。纤维膜等。突出优点是细胞位置固定，易于获得高密度细突出优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物理化学梯度，利于细胞胞群体及维持细胞间物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。次级代谢产物。实例：辣椒细胞固定化培养生产辣椒素。实例：辣椒细胞固定化培养生产辣椒素。植物细胞培养基本技术