第14章基因重组和基因工程药事情.ppt

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1、目录目录 Genetic Recombination and Genetic Engineering第第1414章章目录目录第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移是经常发生的是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature目录目录第二节第二节 重组重组DNA技术技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 目录目录相关概念相关概念n DN

2、A克隆克隆n 工具酶工具酶n 目的基因目的基因n 基因载体基因载体基本原理基本原理 重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系本节主要内容：本节主要内容：目录目录一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆目录目录 技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)（即（即DNA 克隆）克隆）细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或

3、植物）目录目录应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的天然的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具接合成一具有 自 我 复 制 能 力 的有 自 我 复 制 能 力 的 D N A 分 子分 子 复 制 子复 制 子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一提取获得大量同一DNA分子，也称分子，也称基因克隆或基因克隆或重组重组

4、DNA(recombinant DNA)。DNA克隆克隆目录目录 目的：目的：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基因实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组又称重组DNA工艺学。工艺学。目录目录（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶目录目

5、录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 定义：定义：目录目录与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）分类：分类：作用：作用：目录目录第一

6、个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目录目录（三）目的基因（三）目的基因(target gene)感兴趣的基因感兴趣的基因 目录目录（四）基因载体（四）基因载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁为携带目的基因，实现其无性繁殖或表

7、达有意义的蛋白质所采用的殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA载体的主要选择标准：载体的主要选择标准：能自主复制能自主复制目录目录质粒质粒(plasmid)特点特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。目录目录二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构

8、建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目录目录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取化学合成法，从组织中提取等。化学合成法，从组织中提取等。（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。载体的选择和改建方法也不同。（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自

9、连自连目录目录受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式：导入方式：转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌目录目录抗药性标记选择，免疫化学方法等。抗药性标记选择，免疫化学方法等。（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择目录目录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切

10、目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 目录目录重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA c DNA 人工合成人工合成 PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目录目录表达体系的建立：表达体系的建立：表达载体的构建表达载体的构建

11、 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达目录目录第三节第三节 重组重组DNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective目录目录一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。而认识疾病的分子机制。二、生物制药二、生物制药 利用基因工程生产有药用价值

12、的蛋白质、利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为有望成为21世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。目录目录基因工程胰岛素基因工程胰岛素n胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg100Kg胰腺只胰腺只能提取能提取4-5g4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知想而知。目录目录基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)是利用分利用分子生物学及分子遗传的技术和

13、原理，在子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。因的置换、缺失或插入等突变。又称又称DNA诊断诊断。三、基因诊断与治疗三、基因诊断与治疗（一）基因诊断的概念（一）基因诊断的概念目录目录（二）基因治疗的概念（二）基因治疗的概念定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic cell

14、gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗(germ line gene therapy)目录目录1.产前诊断产前诊断2.携带者测试携带者测试3.症候前诊断症候前诊断4.遗传病易感性遗传病易感性四、遗传疾病的预防四、遗传疾病的预防目录目录细菌染细菌染色体色体质粒质粒细菌细菌质粒分离质粒分离重组重组DNA分子分子目的目的DNA分分子插入载体子插入载体感兴趣感兴趣的基因的基因DNA分离分离细胞细胞重组重组DNA分分子转入细菌子转入细菌重组细菌重组细菌转化子细菌转化子细菌目的基因的倍增目的基因的倍增抗虫基因转抗虫基因转入植物入植物目的基因的转入使细菌目的基因的转入使细菌可清理污染物可清理

15、污染物细菌的倍增细菌的倍增产生的蛋白质用于治疗疾病产生的蛋白质用于治疗疾病目的基因的倍增目的基因的倍增大量的蛋白质大量的蛋白质大量的目的基因大量的目的基因目录目录转基因动植物转基因动植物目录目录 转基因生物的生产转基因生物的生产转基因小鼠转基因小鼠不易腐烂的番茄不易腐烂的番茄目录目录Carolina cotton producers have reduced pesticidesprays and lowered production costs by utilizing genetically engineered cotton varieties目录目录目录目录目录目录目录目录小结小结1.基因工程概念基因工程概念2.重组重组DNA技术基本操作步骤技术基本操作步骤