第07章氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验.ppt

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1、第第7章章 氨基酸、多肽、蛋白质和氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验酶类药品检验氨基酸类药物含量测定常用的方法氨基酸类药物含量测定常用的方法1.酸碱滴定法酸碱滴定法示例示例1：谷氨酸的：谷氨酸的含量测定含量测定示例示例2：赖氨酸片：赖氨酸片中赖氨酸的测定中赖氨酸的测定2.非水溶液滴定法非水溶液滴定法示例：酪氨酸的示例：酪氨酸的含量测定含量测定3.定氮法定氮法示例：天门酰氨示例：天门酰氨片的含量测定片的含量测定赖氨酸片中赖氨酸的测定中赖氨酸片中赖氨酸的测定中w1)为什么要用为什么要用NaOH调节调节pH为为7.0？w2）加入甲醛溶液的作用？）加入甲醛溶液的作用？w3）是直接滴定还是其他的滴定方式

2、？）是直接滴定还是其他的滴定方式？非水溶液滴定法非水溶液滴定法w非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐类药物的含量。盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐类药物的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。w非水溶剂的种类非水溶剂的种类(1)酸性溶剂酸性溶剂有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱度，最常用的酸性溶剂为冰醋酸。度，最常用的酸性溶剂为冰醋酸。(2)碱性溶剂碱

3、性溶剂有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸度，最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。度，最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。定氮法定氮法w样品与浓硫酸共热样品与浓硫酸共热,含含氮有机物即分解产生氨氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品和的程度可计算得样品之氮含量。之氮含量。4.碘量法或溴量法碘量法或溴量法示例一：盐酸示例一：盐酸半胱氨酸水合物半胱氨酸水合物的测定

4、的测定示例一：示例一：L-胱氨胱氨酸的测定酸的测定5.HPLC法法示例一：三氨示例一：三氨基酸注射液基酸注射液-341示例二：六氨示例二：六氨基酸注射液基酸注射液4006.氨基酸自动分析氨基酸自动分析仪仪碘量法碘量法w原理：半胱氨酸分子中含有原理：半胱氨酸分子中含有SH，在酸性在酸性条件下，与过量的碘作用，剩余的碘用硫代条件下，与过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠溶液滴定。由硫代硫酸钠溶液所消耗硫酸钠溶液滴定。由硫代硫酸钠溶液所消耗的量，间接求出硫化物的含量。的量，间接求出硫化物的含量。w注意：滴定条件，指示剂，碘滴定液，注意：滴定条件，指示剂，碘滴定液，Na2S2O3 标液配制标液配制 碘量

5、法的背景知识碘量法的背景知识w(一一)方法简介方法简介w 碘量法也是常用的氧化还原滴定方法之一。它碘量法也是常用的氧化还原滴定方法之一。它是以是以I2的氧化性和的氧化性和I-的还原性为基础的滴定分析法。的还原性为基础的滴定分析法。因此，碘量法的基本反应是因此，碘量法的基本反应是 -2-O2I/II+2e=2I =0.535 VEn由由E可知可知I2是一种较弱的氧化剂，能与较强的还原是一种较弱的氧化剂，能与较强的还原剂作用；而剂作用；而I-是一种中等强度的还原剂，能与许多是一种中等强度的还原剂，能与许多氧化剂作用，因此碘量法又可以用直接的和间接的氧化剂作用，因此碘量法又可以用直接的和间接的两种方

6、式进行滴定。两种方式进行滴定。n 1、碘滴定法、碘滴定法(也称直接碘量法也称直接碘量法)n 电位比电位比EI2/I低的还原性物质，可以直接用低的还原性物质，可以直接用I2的的标准溶液滴定的并不多，只限于较强的还原剂，如：标准溶液滴定的并不多，只限于较强的还原剂，如：S2-、SO32-、Sn2+、S2O32-、AsO32-、SbO33-等。等。w剩余碘量法剩余碘量法w在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液，在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液，待待I2与测定组分反应完全后，再用硫代硫酸与测定组分反应完全后，再用硫代硫酸钠滴定液滴定剩余的碘，根据与药物作用的钠滴定液滴定剩余的碘，根据与药物作用的

7、碘的量来计算药物含量的方法。碘的量来计算药物含量的方法。w 2、滴定碘法、滴定碘法(间接碘量法间接碘量法)w 电位比电位比EI2/I高的氧化性物质，可在一定的条件高的氧化性物质，可在一定的条件下，用碘离子来还原，产生相当量的碘，然后用下，用碘离子来还原，产生相当量的碘，然后用Na2S2O3标准溶液来滴定析出的标准溶液来滴定析出的I2，这种方法叫做间，这种方法叫做间接碘量法或称为滴定碘法。例如接碘量法或称为滴定碘法。例如K2Cr2O7在酸性镕液在酸性镕液中与过量的中与过量的KI作用，析出的作用，析出的I2用用Na2S2O3标准溶液滴标准溶液滴定。定。w Cr2O72-+6I-+14H+2Cr3+

8、3I2+7H2Ow I2+2S2O322I-+S4O62利用这一方法可以测定很多氧化性物质利用这一方法可以测定很多氧化性物质,如如ClO3-、ClO-、CrO42-、IO3-、BrO3-、SbO43-、MnO4-、MnO2、AsO43-、NO3-、NO2-、Cu2+、H2O2等等，以等等，以及能与及能与CrO42-生成沉淀的阳离子，如生成沉淀的阳离子，如Pb2+、Ba2+等，等，所以滴定碘法的应用范围相当广泛。所以滴定碘法的应用范围相当广泛。w 碘量法常用碘量法常用淀粉作指示剂淀粉作指示剂，淀粉与碘作，淀粉与碘作用形成蓝色络合物，灵敏度很高，即使在用形成蓝色络合物，灵敏度很高，即使在5106

9、mol/L溶液中亦能看出。溶液中亦能看出。w 淀粉指示剂应在近终点时加入，因为当淀粉指示剂应在近终点时加入，因为当溶液中有大量碘存在时，碘可被吸附在淀粉溶液中有大量碘存在时，碘可被吸附在淀粉表面，影响终点的正确判断。表面，影响终点的正确判断。w 碘滴定液碘滴定液(0.1mol/L)I2=253.81 12.69g1000ml 【配制配制】取碘取碘13.0g,加碘化钾加碘化钾36g与水与水50ml溶解后，加盐酸溶解后，加盐酸3滴与水适量使成滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。w 碘量法的主要误差来源碘量法的主要误差来源，一是，一是I2易挥发，二是易挥发

10、，二是I-易被空气中的氧所氧化。易被空气中的氧所氧化。w 为防止为防止I2挥发，应采取以下措施：挥发，应采取以下措施：w 1.加入过量加入过量KI，KI与与I2形成形成I3，以增大，以增大I2的溶解的溶解度，降低度，降低I2的挥发性，提高淀粉指示剂的灵敏度。的挥发性，提高淀粉指示剂的灵敏度。w 此外，加入过量的此外，加入过量的KI，可以加快反应的速度和，可以加快反应的速度和提高反应的完全程度。提高反应的完全程度。w 2.反应时溶液的温度不能高，一般在室温下进行。反应时溶液的温度不能高，一般在室温下进行。因升高温度增大因升高温度增大I2的挥发性，降低淀粉指示剂的灵敏的挥发性，降低淀粉指示剂的灵敏

11、度。保存度。保存Na2S2O3溶液时，室温升高，加速溶液时，室温升高，加速Na2S2O3的分解。的分解。w 3.析出碘的反应最好在带塞的碘量瓶中进行，滴析出碘的反应最好在带塞的碘量瓶中进行，滴定切勿剧烈摇动。定切勿剧烈摇动。w 为防止为防止I-被空气中的氧所氧化，被空气中的氧所氧化，应采取以下措施应采取以下措施：w 1.避光避光 光线能催化光线能催化I被空气氧化。被空气氧化。w 2.溶液溶液pH值的影响值的影响 S2O32与与I2之间的反应必须之间的反应必须在中性或弱酸性溶液中进行。因为在碱性溶液中，在中性或弱酸性溶液中进行。因为在碱性溶液中，I2与与S2O32将会发生下述副反应：将会发生下述

12、副反应：w S2O32+4I2+10 OH2SO42+8I十十5H2Ow 而且，而且，I2在碱性溶液中还会发生歧化反应：在碱性溶液中还会发生歧化反应：w 3 I2+6OHIO3+5I+3H2Ow 如果在强酸性溶液中，如果在强酸性溶液中，Na2S2O3溶液会发生分解：溶液会发生分解：S2O32+2H+SO2+S+H2Ow 同时，同时，I在酸性溶液中也容易被空气中的在酸性溶液中也容易被空气中的O2氧化：氧化：w 4I+4H+O2=2I2+2H2O w 3.在间接碘量法中，当析出碘的反应完成后，应在间接碘量法中，当析出碘的反应完成后，应立即用立即用Na2S2O3进行滴定进行滴定(避免避免I2的挥发和

13、的挥发和I被空气氧被空气氧化化)。w（二）应用实例（二）应用实例w1.铜矿石中铜的测定铜矿石中铜的测定w 矿石经矿石经HCl、HNO3、溴水和尿素处理成溶液后、溴水和尿素处理成溶液后、用用NH4HF2掩蔽试样中的掩蔽试样中的Fe3+，使其形成稳定的，使其形成稳定的FeF63-络合物，并调节溶液的络合物，并调节溶液的pH为为3.54.0，加入，加入KI与与Cu2+反应，析出的反应，析出的I2，用，用Na2S2O3标准溶液滴定，以淀粉为标准溶液滴定，以淀粉为指示剂，反应式如下：指示剂，反应式如下：w 2Cu2+4I2CuI+I2w I2十十2S2O322I+S4O62w 本法可测定矿石中本法可测定

14、矿石中0.5%以上的铜。以上的铜。w 2.钡盐中钡的测定钡盐中钡的测定w 在在HAc-NaAc缓冲溶液中，缓冲溶液中，CrO42能将能将Ba2+沉淀为沉淀为BaCrO4。沉淀经过滤、洗。沉淀经过滤、洗涤后，用稀涤后，用稀HCl溶解，加入过量溶解，加入过量KI，Cr2O72将将I氧化为氧化为I2，析出的，析出的I2，以淀粉为，以淀粉为指示剂用指示剂用Na2S2O3标准溶液滴定。反应式标准溶液滴定。反应式如下：如下：w Ba2+CrO42BaCrO4(黄黄)w 2BaCrO4+4H+2 Ba2+H2Cr2O7+H2Ow Cr2O72+6I+14H+3I2+2Cr3+7H2Ow I2+2S2O322

15、I+S4O62HPLC（高效液相色谱）柱的类型：柱的类型：检测器类型：检测器类型：固定相：固定相：流动相：流动相：氨基酸自动分析仪w一种专门用来分析氨基酸的自一种专门用来分析氨基酸的自动化的液相色谱仪。动化的液相色谱仪。w原理：蛋白质经盐酸水解原理：蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分酸分析仪的离子交换柱分离，与茚三酮溶液产生颜离，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。计比色测定氨基酸含量。w 一份水解液可同时测定天一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，精氨酸等冬，苏，丝，精氨酸等16种氨基酸。种氨基酸。多

16、肽类药品检测1.酸碱滴定法酸碱滴定法2.紫外分光光度法紫外分光光度法3.效价测定法（略）效价测定法（略）示例一：抑肽酶效价的测定示例一：抑肽酶效价的测定 示例二：杆菌肽效价的测定示例二：杆菌肽效价的测定蛋白质类药品的检验蛋白质类药品的检验w定氮法定氮法w电泳法（重点介绍）电泳法（重点介绍）w生物检定法生物检定法w电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。荷的电极移动的现象。w醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm0.15mm为宜。为宜。w特点：操作简单、灵敏度高，样品用量少。电泳时特点：操作简单、灵敏度高，样品用量少。电泳时间短，一般电泳间短，一般电泳4560min即可，加上染色，脱色，即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需整个电泳完成仅需90m