食品安全快速检测-复习资料.docx

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1、一、食品安全问题国内2008年奶粉三聚鼠胺，2010年7月又重现江湖；2010年的海南“电豆事件”及“农夫山泉事件”；2010年8月出现的“圣元奶粉早熟事件”国外2010年8月美国的鸡蛋沙门氏菌事件；2010年8月出现的超级细菌事件。2010年10月26日，中国疾病预防控制中心发布信息称，近期检测出三株NDM-I耐药基因阳性细菌。这三个病例分别来自于今年3月和6月提取的细菌样本，特别是两例新生儿病例，基本可以由此排除境外传入的可能。此次所测细菌的实际取样时间，早于英国科学家发现NDM-I之前。这也就表明，早在英国科学家发现超级细菌之前，超级病菌此前就在中国存在。“分别在宁夏和福建查出的含NDM

2、-I耐药基因细菌病例，可以理解成该耐药基因可能已经存在于人群中，只是尚未被检测到。”10月27日，中国疾控中心办公室主任王健在接受本报记者采访时说。二、食品安全快检技术与食品分析的区别内容上；分析手段上；分析的目的。免疫标记技术（放射免疫、荧光免疫、胶体金免疫技术及酶联免疫技术）oPCR（polymerasechainreaction）技术。基因芯片技术。生物酶抑制技术等。三、主要内容（理论）第一章免疫技术重点为ELISA技术第二章基因食品的检测重点为PCR技术第三章食品中有害化学物质的检测重点为胆碱酯酶抑制法测定农药,微生物生长抑制法测定抗生素第四章食品中有害微生物的快速检测重点为微生物的显

3、色培养快速检测法第五章食品中毒素的快速检测重点为生物法测定食品中的毒素第一章免疫学技术第一节有关免疫的基本理论一抗原与抗体的基本理论（一）抗原1抗原的定义完全抗原：进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞（免疫原性），并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质（免疫反应性）。半抗原：只具有免疫反应性。2免疫原性抗原能否成功诱导宿主产生免疫应答取决于三个方面：抗原异质性：抗原物质和宿主本身物质之间的差异，抗原物质的来源和宿主的亲缘关系越远，抗原性越强；分子量：越大，免疫原性越强；化学结构：蛋白质多糖和核酸；支链、环状结构直链，球形线形分子。宿主个体发

4、育、生理状态和遗传性等都对免疫原性有很大影响，所以不同动物，同种动物的不同个体的免疫都有差异。免疫方式主要包括抗原的进入途径、剂量、次数、间隔时间等。3特异性体现在免疫原性及免疫反应性上。一种抗原只能诱发一种特异的免疫应答，结果形成特异性抗体或致敏淋巴细胞；抗原只能与其诱导的特异性抗体或致敏淋巴细胞进行反应，这是其在食品安全快检中得以广泛应用的基础。抗原的特异性是由抗原决定簇决定的，抗原决定簇是抗原分子上具有一定组成和结构的特殊化学基团，多数天然抗原分子通常存在多种抗原决定簇，一般来讲，不同的抗原其抗原决定簇不同，但有时，某一种抗原决定簇也会出现在其他抗原分子上,使其成为共同抗原决定簇，这种抗

5、原决定簇是抗原抗体交叉反应的基础。4抗原分类根据来源分：天然、人工和合成抗原三类，天然抗原指天然的生物、细胞及天然产物；人工抗原指人工化学改造后的抗原，如半抗原经化学改造后就是人工抗原；合成抗原是指化学合成的抗原，比如氨基酸的聚合物。根据水溶性分：不溶的颗粒抗原和可溶性胶体抗原，如细菌的鞭毛、纤毛和菌体都是颗粒抗原；蛋白质、多糖、DNA和真菌毒素都是可溶性胶体抗原。按亲缘关系不同：自身抗原、同种型抗原、异种抗原。按免疫应答机理：普通抗原和超级抗原（极低浓度的抗原产生非常强的免疫效应）。（二）抗体1抗体的定义、分布和分类抗原刺激宿主免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和抗原发生特异性结合的免疫球蛋

6、白（immunoglobin,Ig）。主要存在于动物的血清中，也存在于体液和体外分泌液，如乳汁和细胞分泌液中。Ig包括很多种类，比如人类的Ig可分为IgGIgM.IgA、IgD.IgE五大类，其中IgG、IgA分别可进一步分成IgGhIgG2、IgG3、IgG4和IgAl、IgA2亚类。2抗体的结构以人的Ig为例，IgG、IgDIgE以抗体单体形式存在，而IgM由五个抗体单体通过J链连接在一起的五聚体，因此IgG.IgD.IgE属二价抗体，而IgM为十价抗体。二抗原和抗体的制备（一）抗原的制备1细菌细胞抗原的制备通常将细菌于固体培养基上培养，挑取菌落入无菌生理盐水中，灭菌，离心，用无菌生理盐水

7、配制成菌悬液，备用。2可溶性抗原制备与纯化蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、脂多糖、细菌外毒素等可溶性抗原中相当部分来源于组织细胞，成分比较复杂。通常需要将组织和细胞破碎，经一定的方法纯化后才能获得所需的抗原。（1）通过酶（溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等）消化细胞溶菌酶：主要通过水解肽聚糖的N-乙酰胞壁酸和N乙酰氨基葡糖之间的B-1,4糖甘键，由此可见，更适合于G+；纤维素酶：也能水解B-1,4糖昔键；蜗牛酶：消化腺中发现有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酸、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸转移酶等多种具有生物活性的混合酶。（2）反复冻融、或者超声波破碎。（3）表面活性剂处理使细胞壁

8、破坏。通过上述三种方法使细胞内容物溢出，通过离心除去细胞碎片即可。如果要制备单一成分的抗原，如蛋白质，还需经过离心、盐析、凝胶色谱、离子交换色谱等方法纯化。3半抗原免疫原的制备及检验属于半抗原的物质是低分子量的物质，如多糖、激素、抗生素、农药及其他化学物晶等。这些小分子物质并不是免疫原，只有与合适载体连接后，才有免疫原性。常见的载体有多聚赖氨酸、竣甲基纤维素（CMC）、聚乙烯毗咯烷酮（PVP）,牛血清蛋白（BAS）、卵清蛋白（OV）等。与载体连接方式：物理方法、化学方法物理法：通过载体（CMC、PVP）的电荷和微孔吸附半抗原。化学法：利用某些功能基团将其连接到蛋白质载体上。如果带有游离氨基或竣

9、基以及2种基团都有的半抗原，可直接与载体连接，如果没有，需改造使其带有游离氨基或竣基才能与载体连接。半抗原与载体结合的数目与免疫原性密切相关,一般认为至少要有20个以上的半抗原分子联结到一个载体分子上，才能有效地刺激免疫动物产生抗体。常用吸收光谱法测定。4佐剂与抗原混合，能非特异性地增强抗体应答的物质。目前人和动物用的免疫佐剂主要是金属盐类（氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙等）、乳化的水-油佐剂（也称弗氏佐剂，由液体石蜡与无水羊毛脂加热混溶而成，称不完全弗氏佐剂，再加入死分枝杆菌如卡介苗以增强炎性反应，称完全弗氏佐剂，这类佐剂副反应严重，主要用于动物制备抗体）（二）抗体的制备1多克隆抗体的制备多克隆抗

10、体是抗原或抗原与佐剂的混合物按一定程序直接免疫试验动物后获得的抗血清。不同的抗原决定簇刺激不同的B淋巴细胞（抗体产生细胞）克隆产生的抗体混合物，所以称多克隆抗体。（1）动物选择食品安全中检测有害物质和微生物常用的动物为鼠（大鼠、小鼠、豚鼠）和兔子。（2）免疫步骤注射：通常的方案是少量多次。动物产生有效抗体的过程有一定时间规律，一般在首次接触抗原的7-10天后，动物血清中才有抗体出现，并在14-21天内达到高峰值，这段时期称初次反应，此后一定时间内，如再次接触同一抗原，则特异抗体的生成量将会超过初次反应的许多倍,称二次反应。抗体效价测定：效价在1：16以上，能达到1：64,即可达到要求，应及时采

11、血，否则抗体将会下降。（常用免疫双向扩散法测定）免疫双向扩散法测定效价：溶化琼脂糖放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，冷却凝固，打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50Ul）,周围各孔内分别加入50Pl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37下孵育24h,观察有无沉淀线产生。（3）采血及抗体效价测定采血方式：颈动脉放血、心脏采血、静脉采血方式。抗体收集：抗体存在血清部分，血液室温凝固lh,4C过夜，血块收缩，将血块离心得残存于其内的血清，收集两部分血清，离心，存贮于-20C或-70C。（4）抗体的纯化及鉴定抗体与所有蛋白质一样，具有一定的溶解度、荷电性、分子大小、疏水程

12、度和配体专一性，因而能够利用盐析沉淀、层析和电泳等技术将抗体分离纯化。抗体纯化要先清楚抗体的用途，用于酶标检测时，只需除去干扰实验的杂质即可。常用的方法有盐析、盐析+凝胶过滤、离子交换+凝胶过滤、阳离子交换+阴离子交换+凝胶过滤、盐析+亲和层析、亲和层析+阴离子交换+凝胶过滤等。鉴定：可以用凯氏定氮法测定其含量、或者分光光度法测定蛋白质含量，也可用凝胶电泳检测其纯度。（5）抗体的保存纯化后的抗体保存十分重要，保存不当，可导致抗体效价下降或消失。常用的方法有：液体保存：抗体经过滤除菌后，加入0.1%的NaN3或硫柳汞以防腐，存于4C可保存半年到一年；低温保存：抗体分成小包装，于20C-4（C保存

13、，一般1年效价不会有明显下降，但应防止反复冻融；冷冻干燥保存：冻干后置于普通冰箱4-5年效价无明显下降。2单克隆抗体的制备单克隆抗体是由单一的B淋巴细胞克隆、针对单一的抗原决定簇产生的均一的免疫球蛋白。因为单克隆抗体的制备是以细胞（包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞和融合子等）为实验对象，在制备过程中采用了细胞融合、细胞培养和细胞克隆等细胞工程技术，因此单克隆抗体又称为细胞工程抗体。B淋巴细胞难以在体外长期存活B细胞肿瘤细胞HAT培养液杂交细胞HAT培养微中氨基蝶咻是叶酸降物0）NA合成，管有次黄够虬型舞是睢，F小鼠鲁髓痛细胞系如X63-Ag8缺乏相应的酶母F能合成DNA,因此在HAT培养假中不能增殖

14、而死亡3单抗与多力施的主要特点比较单抗多抗种属来源小鼠兔子、羊、豚鼠等混合物X纯化、标记易难特异性强差制备周期长（最短4个月）短（2个月）制备技术复杂简单经费多少三抗原或抗体的固定化ELISA方法中，常将抗原、抗体通过物理或化学方法，与不溶水的固相载体相结合,使以后的免疫反应都与固相载体发生联系，便于分离结合和游离的免疫反应物，将蛋白质物质与固相载体连接的过程，称蛋白质的固相化或包被技术。可用作固相载体的材料主要两类：一类是天然有机物，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、淀粉及他们的衍生物；一类为人工合成的高分子聚合物，如聚苯乙烯、聚氯乙烯等。固定化的既可通过物理吸附方式，也可通过化学偶联方式。第二

15、节免疫学检测技术一免疫沉淀及免疫凝集反应（一）免疫沉淀（单向免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、对流免疫电泳等）根据抗原、抗体在适量电解质存在条件下 发生特异性结合，形 成抗原-抗体复合物 并出现肉眼可见的沉 淀或浑浊，在固体载 体中表现为沉淀线， 液体中出现絮状物或 液体浑浊。由于其灵敏度较低， 通常作定性分析，食 晶安全检测中主要作对流免疫电泳又叫反方向免疫或免疫电渗电泳,是在琼脂扩散基础上结合电泳技术建立的种简便而快速的方法。此方法能在短时间内得出结果，故可用于快速诊断,敏感性比琼脂双向扩散技术高IO16倍。蛋白质抗原Jj抗体球蛋白均为两性化合物.大部分抗K麻性（Ph值8.2）的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，而在同等条件下的抗体球供H用负电营较弱，由于琼脂带有SOj基,隹毋电感应下使琼脂凝胶中的水带正电荷，因而在电场中向负极移动，形成种推力，称为电渗现象。抗体球蛋臼由于在溶液中带的负电荷较弱,在电场作用下难以克服电浴的作用,因而向负极移动，而抗原分子所带的负电荷较强，在电场中可以克服电渗的作用，向正极移动.在同一电场下，抗原、抗体相向运动，在两者相遇且比例适合时便形成肉眼可见的沉淀线。该