高效液相色谱法2.ppt
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1、1仪器分析仪器分析第第18章章 高效液相色谱法高效液相色谱法High performance liquid chromatography;HPLC(2)2o 高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的主要类型和原理o 高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择Introduction3 对流动相的要求对流动相的要求:不与固定相发生化学反应。对样品有适宜的溶解度。必须与检测器相适宜。粘度小2.化学键合相色谱法的流动相化学键合相色谱法的流动相4 n1/2 -1 k2 R=()()4 1+k2 n:由固定相及色谱柱填充质量决定 :主要受溶剂种类的影响 k:主要受
2、溶剂配比的影响(1)(1)溶剂系统对分离度的影响溶剂系统对分离度的影响5(2)(2)溶剂的强度和选择性溶剂的强度和选择性a.a.溶剂的极性和强度溶剂的极性和强度正相分配色谱:正相分配色谱:流动相极性小于固定相极性,极性小流动相极性小于固定相极性,极性小的先流出,适于极性组分分离。的先流出,适于极性组分分离。反相分配色谱:反相分配色谱:流动相极性大于固定相极性,极性大流动相极性大于固定相极性,极性大的先流出,适于非极性组分分离。的先流出,适于非极性组分分离。6正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时
3、间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性:待测物极性:ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系7b.b.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题(1)尽量使用高纯度试剂作流动相,防止微量杂质长期累)尽量使用高纯度试剂作流动相,防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。(2)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失;柱子。如使固定液溶解流失;(3)试样在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉)试样在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉淀
4、并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。(4)流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外)流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时,流动相不应有紫外吸收。检测器时,流动相不应有紫外吸收。8 GC:填充柱:H=A+B/u+Cu 毛细管柱:H=B/u+Cu HPLC:H=A+Cu3.分离条件的选择分离条件的选择(1)HPLC(1)HPLC中的速率理论中的速率理论9 A=2 dp A减小的措施:降低dp:35m 降低:球形、仄粒度分布固定相 高压、匀浆装柱a.a.涡流扩散涡流扩散(eddy diffusion)(eddy diffusion)10 B=2Dm Dm T/液 气 THPLC为室温 TG
5、C Dm u最佳 (35倍)B/u 可忽略不计b.b.纵向扩散纵向扩散(longitudinal diffusion)(longitudinal diffusion)11C=Cm+Csm+Cs Cs:化学键合相,单分子层。C=Cm+Csm HPLC:H=A+Cm u+Csm u c.c.传质阻抗传质阻抗(mass transfer resistance)(mass transfer resistance)1213 Cm dp2/Dm Csm dp2/Dm C 减小的措施:降低dp 增大Dm:低粘度流动相低粘度流动相 增加柱温增加柱温14 流动相流速提高,色谱柱柱效降低(变化不如在GC中快)一般
6、流量为1ml/min15HPLC的适宜条件:固定相与装柱:固定相与装柱:小粒度、均匀的球形键合相;匀浆法装柱。流动相流动相:低粘度、低流量。(甲醇,1ml/min)柱温柱温:25C16(2)(2)分离条件的选择分离条件的选择a.a.正相键合相色谱法的分离条件正相键合相色谱法的分离条件 一般以极性键合相为固定相,如氰基(分离含双键的化合物)、氨基键合相(分离多基团化合物如甾体、强心苷以及糖类)等 流动相通常采用烷烃加适量极性调节剂17b.b.反相键合相色谱法的分离条件反相键合相色谱法的分离条件 一般以非极性键合相和固定相 最常用ODS(C18),短链烷基键合相用于极性化合物的分离,苯基键合相适用
7、于分离芳香化合物以及多羟基化合物(如黄酮苷类)流动相一般以极性最强的水为基础溶剂,加入甲醇、乙腈等极性调节剂 可选择弱酸(醋酸)、弱碱(氨水)或缓冲盐(磷酸盐、醋酸盐)调节pH,抑制组分理解,增强保留 调节流动相的离子强度也可改善分离效果18c.c.反相离子对色谱法的分离条件反相离子对色谱法的分离条件 C8或C18键合相为固定相 离子对试剂的选择 酸类或带负电荷的物质,常用季铵盐 分析碱类或带正电荷的物质,常用烷基磺酸盐 离子对试剂浓度一般在3-10mmol/L 流动相pH的选择 调节pH使试样组分与离子对试剂全部离子化194.分离类型选择分离类型选择20三、高效液相色谱仪三、高效液相色谱仪2
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