高效液相色谱讲义.ppt

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1、第七章第七章 高效液相色谱法高效液相色谱法第一节第一节 概述概述一、史程、专用术语一、史程、专用术语二、色谱分离过程和类型二、色谱分离过程和类型液固吸附色谱液固吸附色谱液液分配色谱液液分配色谱离子交换色谱离子交换色谱离子对色谱离子对色谱空间排阻色谱空间排阻色谱三、色谱流程和仪器三、色谱流程和仪器四、四、HPLCHPLC的特点的特点速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用第二节第二节 基本理论基本理论一、色谱分离过程一、色谱分离过程（一）液（一）液-固吸附色谱固吸附色谱流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物

2、质吸附作用的不同来分离物质。附作用的不同来分离物质。流动相和固定相都是液体的色谱法即为液流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂渍于载体上的固定相。种是涂渍于载体上的固定相。（二）液（二）液-液分配色谱液分配色谱流动相极性小于固定相极性的液流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相液色谱法称为正相分配色谱法分配色谱法流动相极性大于固定相极性的液流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相液色谱法称为反相分配色谱法分配色谱法

3、（三）离子交换色谱（三）离子交换色谱（四）离子对色谱法（四）离子对色谱法（五）分子排阻色谱法（五）分子排阻色谱法二、色谱流出曲线和保留值二、色谱流出曲线和保留值（一）色谱流出曲线及相关术语（一）色谱流出曲线及相关术语（二）保留值（二）保留值三、分离度三、分离度第三节第三节 定性和定量分析定性和定量分析一、定性分析一、定性分析（一）利用已知物对照法定性（一）利用已知物对照法定性1 1、利用保留特性、利用保留特性2 2、利用不同柱比较、利用不同柱比较（二）色谱法和其他方法结合定性（二）色谱法和其他方法结合定性1 1、利用化学反应定性、利用化学反应定性2 2、利用二极管陈列检测器、利用二极管陈列检测

4、器3 3、收集峰的流出物、收集峰的流出物4 4、HPLC-MSHPLC-MS二、定量分析二、定量分析（一）峰面积或峰高的测量方法（一）峰面积或峰高的测量方法1 1、手测峰高、手测峰高2 2、峰高乘半峰宽、峰高乘半峰宽3 3、剪纸称重、剪纸称重4 4、积分仪测定、积分仪测定5 5、微处理机测定、微处理机测定（二）定量方法（二）定量方法1 1、峰面积归一法、峰面积归一法2 2、外标法、外标法3 3、内标法、内标法4 4、内加法（或追加法）、内加法（或追加法）第四节第四节 高效液相色谱的分离模式高效液相色谱的分离模式一、基本原理一、基本原理二、分类二、分类1 1、吸附色谱、吸附色谱2 2、分配色谱、

5、分配色谱3 3、离子交换色谱、离子交换色谱4 4、分子排阻色谱、分子排阻色谱5 5、亲和色谱、亲和色谱三、三、HPLCHPLC在生物大分子中的应用在生物大分子中的应用在生物大分子中的在生物大分子中的HPLCHPLC中，中，体积排阻色谱体积排阻色谱，离离子交换子交换、反相液相和亲和色谱反相液相和亲和色谱是最常用的分离是最常用的分离模式。模式。第五节第五节 液液-固色谱法固色谱法液液-固色谱法通常称为吸附色谱固色谱法通常称为吸附色谱1 1、载体：硅胶、载体：硅胶2 2、吸附剂吸附试样的能力、吸附剂吸附试样的能力3 3、原理、原理第六节第六节 键合相色谱法键合相色谱法一、正相色谱法一、正相色谱法1

6、1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团。都是极性基团。2 2、分离机制属于分配色谱、分离机制属于分配色谱3 3、主要用于分离极性不同的化合物，特别是、主要用于分离极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。用来分离不同类型的化合物。二、反相色谱二、反相色谱1 1、分离机理、分离机理2 2、固定相、固定相3 3、流动相、流动相第七节第七节 离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱是以离子交换色谱是以离子交换树脂离子交换树脂作为固定相，作为固定相，树脂上具有树脂上具有固定离子基团固定离子基团及及可交换的离子基团可交换的离子基团，当流动相带着组分

7、电离生成的离子通过固定相时，当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子阳离子交换树脂交换树脂和和阴离子交换树脂阴离子交换树脂。种类种类阳离子交换树脂阳离子交换树脂强酸性强酸性弱酸性弱酸性阴离子交换树脂阴离子交换树脂强碱性强碱性弱碱性弱碱性NR2NHRNH2N(CH3)3XNC2H4OH(CH3)2X-SO3HCOOH-PO3H离子交换层析适用性离

8、子交换层析适用性 能在水溶液或含水极性溶剂中产生游能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。水溶性成分的分离。使用离子交换剂使物质分离表使用离子交换剂使物质分离表 样品样品 强酸型强酸型(磺酸型磺酸型)稀稀NH4OH洗脱洗脱 通过液通过液 酸性、中性化合物酸性、中性化合物 解离型、两性化合物解离型、两性化合物 稀稀NaOH洗脱洗脱 强碱型强碱型(季铵型季铵型)强碱型强碱型 稀稀HCl洗脱洗脱 通过液通过液 通过液通过液 酸性化合物酸性化合物 中

9、性化合物中性化合物 解离型物质解离型物质 两性化合物两性化合物 (盐、生物碱盐、生物碱)一、离子交换色谱的分离机理一、离子交换色谱的分离机理1、qxyP+L PL不足之处不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时：忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。换反应的重要因素。2 2、P0+ZD0 Pb+ZDbP P0 0：流动相中溶质的浓度：流动相中溶质的浓度P Pb b：填料表面上被吸附的溶质浓度：填料表面上被吸附的溶质浓度D D0 0：流动相中洗脱剂的浓度：流动相中洗脱剂的浓度D Db b：填料表面上洗脱剂的

10、浓度：填料表面上洗脱剂的浓度Z Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目洗脱剂的数目。K=Pb X(Db)zP0 X(D0)z Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数Kd=Pb P0 在Z值不能忽略时值不能忽略时K=(Db)z(D0)zKdx在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K K与保留与保留体积成比例，同时洗脱过程中，体积成比例，同时洗脱过程中，K Kd d，D Db b是常数，是常数，用用K Kz z表示。表示。K=1(D0)zKzx 1 D0lgK=lg K

11、z+Zlg3 3 结论结论二、离子交换色谱的固定相二、离子交换色谱的固定相1 1、高分子类型填料、高分子类型填料 优点优点a填料的使用寿命长填料的使用寿命长b具有较高的色谱容量具有较高的色谱容量c 很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性有利。有利。结构结构以交联共聚的苯乙烯以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时二乙烯苯为基质，同时也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。类型类型Mono BeadsTSK-gel DEAE-5PW SP-5PWCM-5PW2 2、无机基质型、无机基质型三、离子交换色谱的流动相离子

12、交换色谱的流动相1 1、流动相的、流动相的PHPH值值 离子交换容量受离子交换容量受流动相的流动相的PHPH值影响值影响 改变流动相改变流动相PHPH值，也会影响弱电离的酸值，也会影响弱电离的酸性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的保留值。保留值。流动相流动相PHPH值的变化也能改变分离的选择性值的变化也能改变分离的选择性 对流动相对流动相PHPH值的控制，通常采用缓冲溶液值的控制，通常采用缓冲溶液来实现。来实现。2 2、流动相的离子强度、流动相的离子强度四、离子交换色谱的影响因素四、离子交换色谱的影响因素1 1、填料孔径的影响、填料孔径的影响2 2、柱长

13、的影响、柱长的影响3 3、流速的影响、流速的影响4 4、PHPH值的影响值的影响无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质均显示不同均显示不同PHPH值影响结果，因此决定了它的保值影响结果，因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。留选择性、分离度和回收率等因素。5 5、离子强度的影响、离子强度的影响第八节第八节 体积排阻色谱法体积排阻色谱法一、分离机理一、分离机理1、体积排阻色谱法（体积排阻色谱法（SECSEC）或空间排阻色谱法（或空间排阻色谱法（SECSEC）或凝胶色谱法或凝胶色谱法2、凝胶过滤色谱法（凝胶过滤色谱法（GFCGFC）Sephade

14、x 葡聚糖凝胶3、凝胶渗透色谱法（凝胶渗透色谱法（GPCGPC）4 4、空间排斥理论、空间排斥理论Xm Xsk=Xs/XmVR=V0+K VSV V0 0 死体积，相当于凝胶的粒间体积死体积，相当于凝胶的粒间体积V Vs s 色谱柱中凝胶的孔穴总体积色谱柱中凝胶的孔穴总体积二、体积排阻色谱法的特点二、体积排阻色谱法的特点三、体积排阻色谱法的固定相三、体积排阻色谱法的固定相（一）（一）固定相的分类固定相的分类1 1、按固定相基质分类、按固定相基质分类2 2、按固定相机械强度分类、按固定相机械强度分类（二）凝胶固定相的特性参数（二）凝胶固定相的特性参数1 1、渗透极限、渗透极限2 2、分离范围、分

15、离范围3 3、固流相比、固流相比在在SECSEC中常将柱中中常将柱中凝胶孔体积凝胶孔体积中的溶剂称为中的溶剂称为固定相固定相，而将柱中，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积凝胶颗粒间空隙体积中称为中称为流动相流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积的比值称作固流相比。的比值称作固流相比。4 4、柱效、柱效（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点物理因素物理因素影响凝胶色谱柱的性能影响凝胶色谱柱的性能 扩大分离范围扩大分离范围使用两根以上的串联色谱使用两根以上的串联色谱柱柱。更换流动相更换流动相谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量谱图的特

16、点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。在低效排租色谱法，样品分子大小随在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加的增加而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度保持不变。保持不变。在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。四、体积排租色谱法的流动相四、体积排租色谱法的流动相在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值和分离选择性无影响。和分离选择性无影响。溶解样品的良溶剂溶解样品的良溶剂 低黏度溶剂低黏度溶剂 柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀 控制流动相的控制流动相的PH值和离子强度值和离子强度 凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱示差折光检测器示差折光检测器流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。有较大的差别。凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱紫外吸收检测器紫外吸