光反应性活性氧（ROS）测定试验（征求意见稿）及起草说明.docx

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1、附件2光反应性活性氧(ROS)测定试验(征求意见稿)1、范围本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧(RoS)测定试验的基本要求和方法。本方法适用于评价化妆品用化学原料的潜在光毒性。2、试验目的预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。3、术语和定义下列术语和定义适用于本方法。3.1 光反应性(Photoreactivity)化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。3.2 光毒性(PhototoXiCity)皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应。这些光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒

2、性。3.3 辐照度(Irradiance)照射到某一表面的紫外线或可见光的强度，单位为瓦每平方米(Wr)或亳瓦每平方厘米(mWcm2)03.4 光照剂量(Doseflight)照射到某一表面的紫外线或可见光的量=强度X时间(秒),单位为焦耳每平方米(Jm2)或焦耳每平方厘米(cm?)。3.5 活性氧种类(ReactiveOxygenSpecies,ROS)活性氧种类，包括单线态氧和超氧阴离子。3.6 单线态氧(SingletOxygen,SO)由光辐照化学物质通过11型光化学反应产生的一种自由基。3.7 超氧阴离子(SuperoxideAnionSA)由光辐照化学物质通过I型光化学反应产生的一

3、种自由基。4、试验原理一些具有光反应性的化学物质暴露于紫外线时，能诱导发色团激发的某一波长的光子，激发能量转移到氧分子上，发生光化学反应，产生活性氧（包括单线态氧So和超氧阴离子SA）,活性氧是许多光毒性反应中的重要中间物质。单线态氧和咪嗖反应生成的过氧化物中间体对N,N二甲基Y亚硝基苯胺（RNo）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。超氧阴离子与氯化硝基四氮嗖蓝（NBT）反应生成NBT,其在560nm波长下具有光吸收。本试验方法通过分光光度法测定化学物质经紫外线照射后对RNO在440nm下吸光度的减少及对NB在560nm下吸光度的增加来判断该化学物质是否具有光反应性。5、试剂和材料除

4、另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂应在配制后1个月内使用，并且在使用前应超声处理，以免物质析出、沉淀对试验造成影响。主要试剂配制方法如下：5.1 磷酸二氢钠。5.2 磷酸氢二钠。5.3 N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）。5.4 咪嘎。5.5 氯化硝基四氮映蓝（NBT）。5.6 pH7.4的20mmol/L磷酸钠缓冲液（NaPB）称取593mgNaH2PO42H2O（CAS:13472-35-0）H5.8gNa2HPO4-12H2O（CAS:10039-32-4）,加入约90OmL水，混匀，用1mol/L的HCl将PH值调节为7.4

5、,定容至Io（X）mL后混匀。于2C8C冰箱或室温保存。5.7 0.2mmol/LN,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO,CAS：138-89-6）称取3mgRNO,溶于IoOmL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.8 0.2mmol/L咪哇（CAS：288-32-4）称取13.6mg咪喋，溶于IOmL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀，得到20mmol/L咪嗖溶液。用20mmol/L的磷酸钠缓冲液将20mmol/L咪喋溶液稀释100倍，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.9 0.4mmol/L氯化硝基四氮喋蓝（NBT,CAS：298-83-9）称取32.

6、7mgNBT,溶于IOomL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.10 溶剂的选择优先使用分析级二甲基亚碉（DMSO）,对于不溶于DMSo的受试物，可使用20mmol/L的磷酸钠缓冲液作为溶剂。如果受试物在DMSo和磷酸钠缓冲液中不溶或不稳定，也可使用其他溶剂，但应保证受试物在所选溶剂中稳定，且参考化学物质的So值和SA值应在附录A规定的范围内。5.11 待测化学物质溶液的配制待测化学物质的分子量应是已知的。测试终浓度为200molL,如果在200molL浓度下的反应混合物有沉淀、着色或其他干扰等现象，则可以使用20molL为终浓度进行测试。当待测化学物质在20m

7、olL的终浓度下得到阳性结果，表示该物质具有光反应性；但在浓度低于20molL下得到阴性结果，不能表示该物质无光反应性。待测化学物质溶液应现用现配，所有操作均应避免在强紫外线和强可见光照射（例如头顶灯下或在自然光暴露的窗户附近工作），以避免在试验前待测化学物质发生光激活或光降解。待测化学物质在试管中称重，加入5.10项溶剂,涡旋混匀,超声510min,配制成IommoIZL（终浓度200molL）。当终浓度200molL的反应混合物在光照前观察到沉淀、着色或其他干扰等现象时，需将IOmmOI/L的溶液用DMSo稀释成1mmol/L溶液（终浓度20molL）。对于不溶于DMSO的化学物质，使用其

8、他溶剂（如磷酸钠缓冲溶液）时，须使得反应混合物中含有20LDMSO（2%,vv）o5.12 阴性对照及阳性对照以奎宁盐酸盐二水合物（CAS：6119-47-7）作为阳性对照，以二苯甲酮-4（CAS：4065-45-6）作为阴性对照。用DMSO按与受试物相同的方法将阳性对照和阴性对照配制成10mmol/L的储备溶液，分装后于20冰箱冻存，于使用当天解冻，避免反复冻融，1个月内使用完毕。6、仪器和设备6.1 太阳光模拟器6.1.1 选择合适的光源用于提供紫外线和可见光的照射，通过渡光片减少波长小于29Onm的UVe,使光源尽量接近室外日光。推荐的测试条件如下：a）配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线

9、波长29Onm）（见附录B）一辐照度：L8mWcm2至2.2mWc照射1小时（例如，AHaSSlmteStCPS+的指标设置值为250W?）,UVA光照剂量：6.5Jcm2至7.9JZcm2（见附录B）。b）配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线波长30Onm）（见附录B）-辐照度：3.0mWcm25.0mWcm2,照射1小时（例如，SericSXL-2500V2）,UVA光照剂量：11J/cn?至18Jc?（见附录B）O1.1.2 测试条件根据实际选择合适具体条件。1.1.3 ROS的产生受温度影响,太阳光模拟器应配备温度控制装置,光照期间温度在2029。6.2 反应容器推荐使用石英反应容器（规

10、格见附录C）,避免液体蒸发以及由于塑料盖造成的UV损失。也可使用其他UV透射率大于95%的盖子或密封件替代。实验室使用其他容器时，应使用附录A中的参考化学物质（序号1/7号）确定合适的仪器辐照度及光剂量。6.3 酶标仪。6.4 UVA紫外照度计。6.5 显微镜。6.6 析步骤7.1 将下列成分在避光条件下混合：7.1.1 溶剂为DMSo的受试物：单线态氧SO超氧阴离子SA20mmol/LNaPB480L20mmol/LNaPB855L0.2mmolL咪晚250L0.4mmol/LNBT125L0.2mmol/LRNO250L10或1mmol/L受试物20L10或1mmol/L受试物20L7.1

11、.2溶剂为NaPB的受试物：单线态辆SO超氧阴离子SA20mmolLNaPB460L20mmolLNaPB835L0.2mmol/L咪哇250L0.4mmol/LNBT125L0.2mmol/LRNO250LDMSO20LDMSO20L10或1mmol/L受试物20L10或1mmoI/L受试物20L以20L溶剂替代受试物，作为空白对照。涡旋或超声5-10min后，将200L反应混合物加入到96孔板中，每组设置3个平行。96孔板加样详见附录D。7.2 在100倍显微镜下检查反应混合物中各组分溶解情况。如有沉淀、析出等现象，需降低受试物浓度重新检测或停止检测。将96孔板震荡5s后，使用分光光度计或

12、酶标仪测定光照前So检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。7.3 将96孔板置于石英反应器中，或盖上其他具有高UV透射率的盖子或密封件，置于太阳光模拟器中照射Iho记录光照前后的温度。7.4 完成光照后，将96孔板震荡1min,使用分光光度计或酶标仪测定光照后SO检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。试验步骤流程图见附录E。8、分析结果表述8.1 So值和SA值的计算计算受试物及对照品的SO值和SA值，根据三个平行孔的数据计算平均值和标准偏差。1 .根据光照前后So测试孔在440nm下的吸光度计算受试物的So值SO值=440(一)-A4M-(

13、a-b)1000式中：A44(一):光照前44Onm下的吸光度A44o(+):光照后44Onm下的吸光度a：光照前空白对照440nm下的吸光度b：光照后空白对照440nm下的吸光度2 .根据光照前后SA测试孔在560nm下的吸光度计算受试物的SA值SA值=i4s6()56o(一)(b-a)X1000式中：A56o():光照前56Onm下的吸光度A56o(+):光照后56Onm下的吸光度a：光照前空白对照560nm下的吸光度b：光照后空白对照56Onm下的吸光度8.2 试验接受标准试验应满足以下标准：1 .光照前，反应混合物中没有受试物沉淀。2 .光照前后，受试物对反应混合物没有颜色干扰。3 .

14、试验过程中温度控制在20C-29C范围内。4 .所有测试孔A440及A560应在0.02-1.5范围内。5 .应根据历史数据平均值2标准偏差建立实验室内阴性对照与阳性对照的质控范围。以下为根据验证数据得出的95%置信区间：200molL奎宁盐酸盐二水合物200molL二苯甲酮-4SO：319至583SA：193至385SO：-9至11SA：-20至-26 .3受试物的光反应性评判标准根据以下标准评判受试物的光反应性:分类样品浓度SOSA25和70具有光反应性200molL7025和70和/或有干扰具有弱光反应性200molL25和20,70具有光反应性20moIL25和20无光反应性200molL25和20不确定不属于上述任何一种情况如受试物在200molL和20molL浓度下均有沉淀、着色或其他干扰，则认为该受试物不适用于本方法，受试物的光反应性不确定。附录A参考化学物质检测结果可接受范围表A17种参考化学物质SO值和SA值测定数据的可接受范围。编号化学物名称CAS编号SOSA溶齐IJ浓度1对氨基苯甲酸150-13-0812-11-7DMSO200molL2对氨基苯甲酸乙酯94-09-7-79-7-17DMSO200molL3盐酸多西环素10592-13-9115-429230-468DMSO200molL