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1、2023嗜酸性粒细胞直接计数方法一、原理用嗜酸粒细胞稀释液将全血稀释一定倍数,并破坏红细胞和大部分其他白细胞,使嗜酸粒细胞颗粒着色,混匀后滴入血细胞计数板内,计数一定范围内嗜酸粒细胞数,可换算为单位体积即每升血液中嗜酸粒细胞数。二、器材与试剂1、器材:显微镜、血细胞计数板及专用血盖片、试管、LOmI刻度吸管吸耳球、一次性微量吸管、乳胶吸头、末梢血用器材和消毒剂、医用棉签或优质卫生纸。2、试剂:常用的嗜酸粒细胞计数稀释液有以下几种。(I)HinkeIman稀释液:伊红0.2g,95%苯酚0.5ml,40%甲醛0.5ml,蒸留水加至100mI。(2);臭甲酚紫稀释液:漠甲酚紫25.0mg,磷酸盐缓
2、冲液(0.1molLzpH7.4)1.0mL蒸储水加至50.0mlo该稀释液为低渗溶液,能使红细胞和其他白细胞溶解。嗜酸性颗粒为非水溶性,因此不被溶解。浪甲酚紫为指示剂,使嗜酸颗粒显紫色,便于识别。少量磷酸盐缓冲液可缓冲澳甲酚紫中的游离酸。乙醇-伊红稀释液:95%乙醇30ml,甘油IomI,碳酸钾LOg,柠檬酸钠0.5g,20gL伊红液IomI。乙酸为嗜酸粒细胞保护剂,甘油可防止乙醇挥发,碳酸钾促使红细胞和其他白细胞溶解破坏,并增强嗜酸粒细胞着色。柠檬酸钠是抗凝剂。伊红是嗜酸性染料,可使嗜酸颗粒着红色。本配方嗜酸粒细胞着色鲜明,缺点是稀释液中含有较黏稠的甘油,细胞不易混匀,故需要计数前必须充分
3、振摇。3、标本:EDTA盐抗凝静脉血或末梢血三、操作步骤1、加稀释液:取小试管1支,加入嗜酸粒细胞稀释液0.38ml。2、采血用75%(VV)乙醇将左手环指指端皮肤消毒,待乙醇挥发干燥后,用一次性采血针穿刺,使血液自然流出,弃去第一滴血,再用一次性微量吸管准确吸取毛细血管血液20lo或直接用EDTA盐抗凝血。3、稀释血液:用棉签或软纸擦去微量吸管管外余血,将其插入稀释液底部,缓缓放出血液,再吸取上层稀释液吸洗微量吸管23次,混细胞悬液室温静置。待红细胞被完全溶解。4、充池:轻微振荡试管,将细胞悬液充分混匀,用微量吸管吸取细胞悬液15l左右,充人清洁而干燥的计数室内,静置23min,待细胞完全下
4、沉到计数池的底面时,于显微镜下进行计数。5、计数:低倍镜下(必要时用高倍镜)计数两个计数池中(中央及四角5个大方格)10个大方格内嗜酸粒细胞数,计数原则同红细胞计数。根据所用稀释液不同,嗜酸粒细胞颗粒可染成不同颜色。三种稀释液处理血标本后,高倍镜下(X40倍物镜)嗜酸粒细胞的形态特征。6、计算:嗜酸性粒细胞/L=(10个大方格内的嗜酸粒细胞10x20x106)/107、结果:报告嗜酸粒细胞*109Lo8、参考区间:(0.020.52)109Lo四、注意事项1、器材:本试验要求各种用具清洁,否则将影响嗜酸性粒细胞着色计数。2、稀释液:(1)嗜酸粒细胞直接计数法中所用稀释液种类繁多,虽配方不同,但
5、作用大同小异,分为保护嗜酸粒细胞而破坏其他细胞的物质(如乙醇丙酮等)和使酸粒细胞颗粒着色的物质(如溪甲酚紫、伊红、石楠红等)(2)Hinkelman液是较为理想的稀释液,它可以在室温中保存较长的时间。(3)其他配方中凡含有挥发性药物如乙醇、丙酮等试剂者,其保存时间均不宜太长并注意密封。(4)因乙醇、丙酮具有挥发性,如用此配方最好新鲜配制效果好最好每周配一次。(5)试剂应在操作前加入试管并及时测定,否则也会因挥发而影响结果。(6)若嗜酸粒细胞被破坏,可在稀释液中适当增加乙醇、丙酮等保护剂的用量,相反,中性粒细胞破坏不全,可适当减少保护剂的量,调整后重新采血计数。3、血标本采集:观察嗜酸粒细胞计数的变化,采集血标本时间应力求统-,以免受日间生理变化的影响。4、血液稀释:血液稀释后应及时混匀,因嗜酸粒细胞在稀释液中容易发生聚集,但不宜用力振荡,以免嗜酸粒细胞破碎。血液稀释后应在3060min内计数完毕,否则嗜酸粒细胞会逐渐溶解破坏,使计数结果偏低,且不易识别。5、细胞鉴别注意与残留的中性粒细胞区别,以免认错后使结果偏高。中性粒细胞一般不着色,但也有着浅红色的,但其颗粒较小。