流式细胞术及其临床应用.pptx

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1、 流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer) 是是现代物理电子技术、激光技现代物理电子技术、激光技术、术、计算机技术以及计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器一体的新型高科技仪器；当细胞；当细胞（或其他粒子）以单个方式（或其他粒子）以单个方式依次通过探测依次通过探测光束时，能够光束时，能够采集采集细胞被光照时产生的各种信细胞被光照时产生的各种信号号，然后，然后对信号进行处理对信号进行处理，并能，并能对多个参数进行关联分析对多个参数进行关联分析的的一种一种仪器仪器 流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry，FCM

2、) 利用利用流式细胞仪流式细胞仪对处于对处于快速直线流动状态快速直线流动状态中的中的单列细胞单列细胞或或生物颗粒生物颗粒进行逐个、多参进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的数、快速的定性、定量分析或分选的技术技术流式细胞术流式细胞术激光激光技术、计算机技术、技术、计算机技术、显微显微荧光荧光技术、光电子技术技术、光电子技术、流体喷射流体喷射技术、技术、单克隆抗体单克隆抗体技术技术、纳米技术、纳米技术以及以及分子生物学分子生物学和免疫学等多和免疫学等多门学科知识门学科知识现代现代科学技术发展的综合交叉的产物，是集多种技术发展于一体科学技术发展的综合交叉的产物，是集多种技术发展于一体的的“

3、大成者大成者”广泛应用在免疫学、细胞遗传学、肿瘤生物学和血液学等多学科广泛应用在免疫学、细胞遗传学、肿瘤生物学和血液学等多学科领域领域20世纪世纪70年代发展至今，仪器设备更趋完善，在应用上也逐渐由年代发展至今，仪器设备更趋完善，在应用上也逐渐由基础研究进入到基础研究进入到临床检验医学临床检验医学领域，为细胞分析提供全新手段领域，为细胞分析提供全新手段1930 Caspersson & Thorell 细胞细胞计数计数1940 Coons结合结合荧光素荧光素的的抗体抗体去标记细去标记细胞胞内特定内特定蛋白蛋白1934 Moldaven细胞细胞检测检测自动化自动化光电光电仪记录流过仪记录流过一根

4、毛细管的一根毛细管的细细胞数胞数 1949 Wallace Coulter悬悬液中计数液中计数粒子粒子的的方法并获专利方法并获专利1950 Caspersson显微分光光度计显微分光光度计UV-VIS光谱区检光谱区检测测细胞细胞1953 Croslannd Taylor根据分层根据分层鞘流鞘流原理成功原理成功设计设计红细胞红细胞光学自动光学自动计计数器数器1969 Van Dilla及同事及同事在在Los Alamos, NM发明发明第一台第一台荧光检测荧光检测细胞计细胞计1972 Herzenberg荧光激活细胞分选仪荧光激活细胞分选仪荧光标记抗体染色的荧光标记抗体染色的细胞的较弱荧光信号细

5、胞的较弱荧光信号1975 Kohler单克隆抗体单克隆抗体为细胞研究提供大为细胞研究提供大量的特异免疫试剂量的特异免疫试剂流式细胞术发展史1973 BD公司与公司与斯坦福大学合作斯坦福大学合作第一台商用第一台商用流式流式细胞仪细胞仪分析型分析型流式细胞仪流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用分选型分选型流式细胞仪流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选胞仪一般只用于

6、分选流式细胞仪的分类计算机与分析系统计算机与分析系统信号收集与信号收集与光电转光电转换系统换系统流动室与液流系统流动室与液流系统光源与光学系统光源与光学系统流式细胞仪构造激发光源激发光源计算机分析计算机分析滤光片滤光片流动流动室、室、鞘鞘液和液和样本流样本流信号检测器信号检测器 激发光源激发光源 光学系统光学系统细胞分选与浓缩系统细胞分选与浓缩系统（一）流动室与液流系统流动室是流式仪核心部件，流动室是流式仪核心部件，被测样品在此与激光相交被测样品在此与激光相交流动室由石英玻璃制成，中流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个央有一长方形小孔，供单个细胞通过细胞通过流动室内充满了鞘液，其作

7、流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕用是将样品环形包绕鞘液流速稳定，样品流在鞘鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息荧光信息（一）流动室与液流系统液流驱动系统液流驱动系统（二）激光光源与光学系统（一）（一）激发光源激发光源 ：激光器：激光器 气体激光器：氩离子气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖、氦氖(633nm)、氪离子、氪离子 (647nm)、氪氩、氪氩(568nm)； 染料激光器：如氩离子激光器的泵浦含有染料激光器：如氩离子激光器的泵浦含有Rhodomin 6G水溶液染料，水溶液

8、染料， 发出发出550-650nm可变波长激发光；可变波长激发光； 半导体激光器半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长；价格低、结构简单、寿命长；BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半导体激光器半导体激光器激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照（二）激光光源与光学系统（二）光（二）光束成行系统束成行系统（二）激光光源与光学系统透镜透镜（二）光（二）光束成行系统束成行系统滤光片滤光片的组成的组成长通长通 (Longpass，LP)滤片：滤片：只允许特定波长以上的光束通过只允许特定波长以上的光束通过短通短通 (Short

9、pass，SP)滤片：滤片：只允许特定波长以下的光束通过只允许特定波长以下的光束通过带通带通 (Bandpass，BP)滤片：滤片：只允许一定波长范围内的光束通过只允许一定波长范围内的光束通过（二）激光光源与光学系统（三）光收集系统（三）光收集系统（二）激光光源与光学系统 480 520 460 500 540（三）光收集系统（三）光收集系统 480 520 460 500 540 480 520 460 500 540光信号的类型光信号的类型 散射光信号散射光信号：与标记荧光素无关，与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数是细胞的固有参数前向散射光前向散射光(forward scatter, F

10、SC)侧向散射光侧向散射光(side scatter, SSC) 荧光信号荧光信号自发荧光自发荧光 ：微弱：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍的荧光，比自发荧光强很多倍（三）信号收集和光电转换系统（一）前向散射光（一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内，度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小体积大小（三）信号收集和光电转换系统（二二）侧向散射光）侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称方向与

11、激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射度散射光，其信号强度反映光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化细胞内部颗粒度和精细结构的变化。（三）信号收集和光电转换系统 R1: 淋巴细胞淋巴细胞 R2: 单核细胞单核细胞 R3: 中性粒细胞中性粒细胞 R4: 裂解碎片裂解碎片（三）信号收集和光电转换系统外周血裂红后外周血裂红后FSC/SSC分布分布（三）荧光信号（三）荧光信号荧光荧光：物质：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光低能状态时释放出的光（三）信号收集和光电转换系统基态基态（三）荧光信号

12、（三）荧光信号细胞细胞经过经过特异荧光素标记后特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的通过对这类荧光信号的检测就检测就能了解所研究细胞参数的存在能了解所研究细胞参数的存在与与定量定量抗原抗原抗体抗体荧光素荧光素激光束激光束（三）信号收集和光电转换系统（三）荧光信号（三）荧光信号常用荧光素常用荧光素（三）信号收集和光电转换系统荧光素分子荧光素分子激发波长激发波长(nm)发射发射光波光波(nm)中文名中文名488525异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素488575藻红蛋白藻红蛋白488677多甲藻黄素多甲藻黄素-叶绿素叶绿素-蛋白质蛋白质 复合物复合

13、物633/635660别藻蓝蛋白别藻蓝蛋白488670藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素5488755藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素7488710（三）荧光信号（三）荧光信号常用荧光素常用荧光素（三）信号收集和光电转换系统能量传递能量传递染料染料 (PE-Cy5 PE-Cy7 PerCp-Cy5.5)用用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在在488nm488nm波长激发光激波长激发光激发后产生的发射波长激发另一发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生荧光信号荧光染料产生荧光信号，最终检测第二荧，最终检测第二荧光染料发射的特定荧光信号光染料发射的特定荧

14、光信号（三）荧光信号（三）荧光信号（三）信号收集和光电转换系统（三）荧光信号（三）荧光信号（三）信号收集和光电转换系统目前常用目前常用FCM配置（配置（BD Calibar）488nm激光管常用染料有激光管常用染料有第一通道（第一通道（FL1）：）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate)第二通道（第二通道（FL2）：）：PE (Phycorey- thrin)第三通道（第三通道（FL3）：）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5633nm激光管常用染料有激光管常用染料有第四通

15、第四通道（道（FL4）：）：APC多色标记荧光素搭配多色标记荧光素搭配原则原则 每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配 FACSCalibur常用四色搭配：常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APCFL-AFL-HFL-W面积（面积（A）：荧光总量）：荧光总量高度（高度（H）：最大荧光强度）：最大荧光强度宽度（宽度（W）：细胞直径）：细胞直径光信号到电脉冲信号光信号到电脉冲信号FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统流式细胞仪信号检测系统（四）计算机和分析系统FCM数据显示方式数据显示方式单参数直方图单

16、参数直方图(Histogram)双参数数据显示：双参数数据显示：散点图散点图(Dot Plot)伪彩图伪彩图(Pseudo-color Plot)等高线图等高线图(Contour Plot)密度图密度图(Density Plot)假三维图假三维图(Pseudo 3D Plot)三维图三维图(3D Plot) 常用分析软件常用分析软件 CellQuest Diva FlowJO WinMDI FCS Express直方图（直方图（Histogram）细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数Event #FL1 FITC110270037204150101102103CountsFITC荧光强度荧光强度（四）计算机和分析系统直方图（直方图（Histogram）（四）计算机和分析系统横坐标既可以是线性的，也可以是对数的横坐标既可以是线性的，也可以是对数的DNA倍体分析倍体分析抗原表达分析抗原表达分析Overlay图图散