白血病分子生物学.ppt

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1、白血病分子生物学白血病分子生物学白血病分子生物学白血病分子生物学白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子检测白血病的分子检测白血病分子检测的临床应用白血病分子检测的临床应用白血病的分子机制白血病的分子机制基因基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所所必需的全部核酸序列。必需的全部核酸序列。癌基因癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导细胞或病毒中存在的，能诱导正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。癌基因活化的方式：癌基因活化的方式： 点突变点突变 染色体重排染色体重排 基因扩增基因扩增抑癌基因抑癌

2、基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，指一类基因，其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑制细胞的恶变。制细胞的恶变。 白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子机制白血病的分子机制增殖增殖过度过度分化分化阻断阻断凋亡凋亡受抑受抑白血病的分子检测白血病的分子检测Southern blotNorthern blotWestern blotFISHPCR测序测序芯片芯片白血病的分子检测白血病的分子检测PCR反应原理反应原理N = N0 x (1+E)n N：扩增子数量扩增子数量N0：起始模板数量起始模板数量E：扩增效

3、率扩增效率n：循环数循环数白血病的分子检测白血病的分子检测PCR理论方程理论方程白血病的分子检测白血病的分子检测PCR方法优点方法优点 快速快速 灵敏灵敏 特异特异PCR方法缺点方法缺点 假阳性假阳性 假阴性假阴性白血病的分子检测白血病的分子检测PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（的范围内（22kbkb），），如如T-ALL中中SIL-TAL1。 RT-PCR：可用于染色体可用于染色体断裂点跨越很大的断裂点跨越很大的区域的融合基因。区域的融合基因。 巢式巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。增加扩增效率。R

4、Q-PCR：可定量扩增产物。可定量扩增产物。白血病的分子检测白血病的分子检测RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物荧光标记扩增产物 荧光标记荧光标记引物引物 特异性荧光标记特异性荧光标记探针探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合荧光染料直接结合扩增产物扩增产物 SYBR Green I与与DNA双链结合双链结合 动态监测荧光信号变化动态监测荧光信号变化TaqMan探针法探针法特异性高特异性高多重基因定量多重基因定量成本较高成本较高SYBR Green I 法法成本低成本低最适合初步筛查最适合初步筛

5、查熔解曲线功能熔解曲线功能无法多重检测无法多重检测无模板特异性无模板特异性灵敏度低灵敏度低白血病的分子检测白血病的分子检测CT值：荧光信号有统计学意义显著增长值：荧光信号有统计学意义显著增长（穿过阈值线）时的循环次数（穿过阈值线）时的循环次数CT值与起始模板量成反比值与起始模板量成反比白血病的分子检测白血病的分子检测RQ-PCR的检测系统：的检测系统：该系统内置了该系统内置了96孔孔PCR仪，且在每个反应孔上仪，且在每个反应孔上均有一个监测探头用于检测均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧反应管中的荧光强度。平均每光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实秒就检测一次，以达到实时检测的目

6、的。时检测的目的。系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，并最终得到并最终得到CT值。值。该系统可以根据标准品的该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘值和拷贝数自动绘制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷贝数。贝数。白血病的分子检测白血病的分子检测RQ-PCR方法优点：方法优点： 灵敏而特异灵敏而特异 起点定量起点定量 闭管化学（污染的风险低）闭管化学（污染的风险低） 没有没有PCR后处理（无需走胶，拍照等）后处理（无需走胶，

7、拍照等） 高度自动化高度自动化 定性：单数据点测定定性：单数据点测定 定量：多数据点测定定量：多数据点测定 能做基因分型及能做基因分型及SNP鉴定鉴定RQ-PCR的操作流程的操作流程从细胞或组织中抽提从细胞或组织中抽提DNA或或RNA用用PCR或或RT-PCR扩增特异片段扩增特异片段 将将PCR产物克隆到合适的载体上产物克隆到合适的载体上纯化，定量和系列稀释质粒纯化，定量和系列稀释质粒DNA或或RNA 体外转录成体外转录成RNA片段（仅用于片段（仅用于RNA样品）样品）构建标准曲线（构建标准曲线（CT lgcopy）样品的定量检测样品的定量检测校正样品基因拷贝数校正样品基因拷贝数白血病分子检测

8、的临床应用白血病分子检测的临床应用白血病的分子生物学检查对白血病诊断分白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义：型及预后判断有以下几方面意义： 补充补充MIC检查的不足检查的不足 发现新的亚型发现新的亚型 监测白血病的微小残留病灶（监测白血病的微小残留病灶（MRD） 为研究白血病的发病机制打下基础为研究白血病的发病机制打下基础 白血病分子检测的临床应用白血病分子检测的临床应用 PCR方法检测方法检测MRD常用的分子标志常用的分子标志 AML1-ETOt(8;21)(q22;q22) 68%原发性原发性AML，在在M2中的阳性率为中的阳性率为2040%，在，在M2b中阳性

9、率为中阳性率为90% 少见于少见于M4和和M1，极少见于极少见于MDS和骨髓增生综和骨髓增生综合症合症 AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对化疗反应较敏感粒细胞，且对化疗反应较敏感 AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他较其他AML亚型（亚型（M3除外）好除外）好 AML1-ETO对初发患者进行对初发患者进行t(8;21)和和AML1-ETO融融

10、合基因的检测对其预后判断及治疗方案合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要的制定相当重要 AML1-ETO定性结果不能用于评价患者定性结果不能用于评价患者MRD(微小残留微小残留)情况情况 RQ-PCR能实时反映体内能实时反映体内AML1-ETO水水平。连续定量平。连续定量AML1-ETO转录水平可判转录水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发干预以防血液学复发 AML1- 阴性阴性 ETO+C-KIT基因突变基因突变C-KIT为为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和和c-KIT）成

11、员之一成员之一C-KIT突变可见于伴突变可见于伴inv(16)的的M4以及伴以及伴t(8;21)的的M2患者患者26/54例例(48.1%) M2b患者中检测到患者中检测到C-KIT基因基因突变突变57例不伴例不伴t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未的其他类型血液肿瘤患者均未检测到检测到C-KIT基因突变基因突变以上结果提示以上结果提示C-KIT突变与突变与M2b密切相关密切相关(R=0.94, P0.01)C-KIT基因突变基因突变C-KIT基因结构基因结构JMC-KIT基因突变基因突变外周血白细胞计数外周血白细胞计数C-KIT基因突变基因突变生存曲线生存曲线PML-RARt(15;17

12、)(q22;q21) 98%M3患者患者继继t(15;17)之后，又先后发现之后，又先后发现4种种M3特异的累及特异的累及RAR的变异性染色体易位：的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及以及dup(17)(q21.3;q23)，分别产生分别产生PLZF-RAR，NPM-RAR，NuMA-RAR和和STAT5b-RAR融融合基因合基因临床上，具有临床上，具有PLZF-RAR ，t(11;17)(q23;q21)，或或STAT5b-RAR ，dup(17)(q21.3;q23)，融合融合基因患者对基因患者对A

13、TRA治疗不敏感，其余三种染色治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解治疗可获完全缓解 PML-RARAPL累及的累及的RAR基因及其伙伴基因结构示意图基因及其伙伴基因结构示意图 PML-RAR由于由于PML基因断裂点基因断裂点不同产生不同产生3种不同的种不同的PML-RAR异构体、异构体、即即PML第第3外显子与外显子与RAR第第3外显子结合形成的外显子结合形成的p3r3(S型，短型型，短型)，PML第第6外显子与外显子与RAR第第3外显子结合形成的外显子结合形成的p6r3(L型，型，长型长型)，极少数患者为，极少数患者为V变异型（变异型（5%）。）。约约55

14、%的的M3患者为患者为L型，型，40%为为S型，型，5%为为V型，且每位患者只表达一种型，且每位患者只表达一种PML-RAR融合蛋融合蛋白白形态学上形态学上S型白血病细胞常为低分化的，型白血病细胞常为低分化的，V型型APL患者的白血病细胞体外对患者的白血病细胞体外对ATRA的敏感度的敏感度低低 PML-RARRT-PCR检测检测PML-RAR是敏感且特异的是敏感且特异的APL诊断方法，还能用于治疗后诊断方法，还能用于治疗后MRD监监测。测。PML-RAR阳性提示的分子复发常阳性提示的分子复发常早于临床复发早于临床复发3-63-6个月，为临床采取进一个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障步治疗

15、措施提供了保障 RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在在MRD监测中比监测中比RT-PCR具有更高价值具有更高价值 L+ 阴性阴性 S+FLT3基因突变基因突变Fms-related tyrosine kinase 3FLT3为为III型受体酪氨酸激酶家族（还包括型受体酪氨酸激酶家族（还包括c-FMS，PDGFR和和c-KIT）成员之一，该类受成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用挥重要调控作用综合国外各研究报道，综合国

16、外各研究报道， FLT3-ITD和和D835突变突变在在AML中阳性率分别为中阳性率分别为24%(385/1585)和和7%(30/429)，总阳性率超过，总阳性率超过30%，使其成为，使其成为AML中最普遍发生突变的靶基因中最普遍发生突变的靶基因许多临床研究发现，许多临床研究发现，FLT3突变还与临床预后突变还与临床预后密切相关，尤对密切相关，尤对60岁以下的岁以下的AML患者，患者，FLT3突变患者预后较差，且可独立于核型之外突变患者预后较差，且可独立于核型之外FLT3基因突变基因突变FLT3基因突变基因突变FLT3基因主要突变类型基因主要突变类型FLT3基因突变基因突变mut-FLT3信号通路信号通路FLT3基因突变基因突变外周血白细胞计数外周血白细胞计数020406080100120140160 FLT3-ITD- FLT3-ITD+APL患者初发时外周血WBC计数(x109)CBF-MYH11inv(16)(p13;q22)及及t(16;16)(p13;q22) 主要见于主要见于M4Eo，10%不伴异常嗜酸细胞不伴异常嗜酸细胞M4，少见于少见于M2CBF-MYH11融合蛋白通