微生物的培养与应用.ppt

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1、 专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用（一一）培养基培养基 人们按照微生物对营养物质的不同需求，人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质称配制出供其生长繁殖的营养基质称 培养基培养基 一般的培养基均需要一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和碳源、氮源、无机盐和水水等（具体见教材等（具体见教材1515页页“100mL100mL牛肉蛋白胨培养牛肉蛋白胨培养基的营养构成基的营养构成”）。）。培养基的基本成分培养基的基本成分培养基的种类培养基的种类（1 1）按物理状态来分：培养基可分）按物理状态来分：培养基可分为为固体培养基固体培养基和和液体培养基液体培养基。其

2、中。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。落等。（2 2）按功能来分，可分为）按功能来分，可分为选择培养选择培养基基和和鉴别培养基鉴别培养基。（3 3）按成分来分，可分为）按成分来分，可分为天然培养天然培养基基和和合成培养基合成培养基。（二二）无菌技术无菌技术 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。所有防止杂菌污染的方法技术。 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。消毒消毒 无菌技术的种类

3、无菌技术的种类灭菌灭菌 使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀死部分对人体有害的微生物。死部分对人体有害的微生物。 对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒；清洁消毒； 将培养皿、接种用具进行灭菌；将培养皿、接种用具进行灭菌； 接种的过程要在酒精灯附近进行。接种的过程要在酒精灯附近进行。使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。有微生物（包括芽孢和孢子）。1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴

4、氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法: :用用75%75%酒精、新洁酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒尔灭等进行皮肤消毒; ;氯气消毒水源氯气消毒水源4 4、紫外线消毒、紫外线消毒(1)消毒的方法：消毒的方法：1.1.灼烧灭菌：灼烧灭菌：接种用具和接种过程中的试管口或瓶口接种用具和接种过程中的试管口或瓶口放在酒精灯火焰的放在酒精灯火焰的充分燃烧层充分燃烧层中进行灼烧灭菌（如教中进行灼烧灭菌（如教材材1616页图页图2-22-2所示）。所示）。（2）常用的灭菌方法）常用的灭菌方法2.2.干热灭

5、菌：干热灭菌：将将玻璃器皿、金属用具玻璃器皿、金属用具等能耐高温并需要等能耐高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在160160170170OC C中加中加热热1 12h2h即可。即可。3.3.高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：将需灭菌的物品放到盛有水的高压将需灭菌的物品放到盛有水的高压灭菌锅内（见教材灭菌锅内（见教材1616页图页图2-42-4）煮沸，待冷空气排尽后，）煮沸，待冷空气排尽后，密闭继续加热至锅内压力到密闭继续加热至锅内压力到100kPa100kPa，温度到，温度到121121OC C后，后，维持维持151530min30min即可。即可。（一一）

6、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏蛋白胨固体培养基配方物质物质牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl琼脂琼脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定容至定容至1000mL1000mL2.2.称量称量 按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。迅速，称后及时盖上瓶盖。 3. 3.溶化：溶化：先将先将牛肉膏连同称量纸牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加一起放入烧杯，

7、加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加蒸馏水定溶之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加蒸馏水定溶至至100mL100mL。 4. 4.灭菌灭菌( (先调先调PH)PH)将配制好的培养基放到锥形瓶中将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），放到高压锅内灭菌；培（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），放到高压锅内灭菌；培养皿（用几层报纸包好）放入干热灭菌箱内灭菌。养皿（用几层报纸包好）放入干热灭菌箱内灭菌

8、。 5. 5.倒平板：倒平板：待培养基冷却到待培养基冷却到5050OC C左右时倒平板（如教左右时倒平板（如教材材1717图示）。图示）。倒平板操作的讨论倒平板操作的讨论 1. 1.培养基灭菌后要冷却到培养基灭菌后要冷却到5050OC C时倒平板。用时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？什么办法来估计培养基的温度？ 2. 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 用手触摸锥形瓶，温度下降到用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手刚刚不烫手时即可时即可开始倒平板。开始倒平板。 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3.

9、3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？为什么？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。上的水珠落入培养基，造成污染。 空气中

10、的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此上滋生，因此最好不要最好不要用这个平板培养微生物。用这个平板培养微生物。（二二）纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌 微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。法。1.1.平板划线法平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作如教将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作如教材材1818页图示）。页图示）。 在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉在数次划

11、线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称眼可见的子细胞群体称菌落菌落。 操作的操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。数目逐渐减少，以便得到

12、菌落。划线结束后仍然要灼烧划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。染环境和感染操作者。 1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？ 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？行划线？ 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？是从上一次划

13、线的末端开始划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。 划线后，线条划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。繁殖而来的菌落。 2. 2.稀释涂布平板法稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培

14、养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。作和涂布平板操作。系列稀释操作系列稀释操作101102103104105106 (1) (1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌并编号。水的试管灭菌并编号。 (2) (2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培养的菌液，注入第二支试管中，培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸

15、三次使之充分混匀。轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。 (3) (3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第三支试稀释液，注入第三支试管中，重复步骤管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。，直至到第六支试管。涂布平板操作涂布平板操作(1)(1)将涂布器浸在盛有将涂布器浸在盛有7070的酒精的酒精的烧杯中。的烧杯中。(2)(2)取少量菌液（不超取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培养基表），滴加到培养基表面。面。(3)(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃引燃，火熄后，火熄后冷冷却却8 810s10s。(4)(4)用涂布器

16、将菌液均匀地涂布在培养基表面。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布平板操作讨论涂布平板操作讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2 2步应如何步应如何进行无菌操作？进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例如，酒精灯。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。 1.1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？落生长，说明了什么？ 2.2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？菌落？它们的大小、形状、颜色相似？ 未接种的培养基在恒温箱中保温未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制