微生物ppt.ppt
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1、人体微生物组学研究的实验和分析工具主要内容主要内容 人体微生物人体微生物 综述目的及意义综述目的及意义 分子生物学一般研究策略分子生物学一般研究策略 人体微生物的研究方法人体微生物的研究方法人体微生物人体微生物 人体内有两个基因组,一个是从父母那里遗传来的人基因组,编码大约2.5万个基因;另一个则是出生以后才进入人体、特别是肠道内的多达1000多种的共生微生物,其遗传信息的总和叫“微生物组”。 人体微生物与人体有着密不可分的联系。人体与其菌群之间进行着活跃的代谢交换以及“co-metabolism”过程,因此在人体病理学等研究中,必须考虑人体微生物群体的组成及其行为对宿主的影响。 人体微生物学
2、的重要性日益凸显,用来识别和分析微生物群落组成技术的新进展很大程度上提高了我们对微生物群落以及它们不同生活环境的认识,包括人类。 在过去的2年中,人体微生物的研究已经开始如:Human Microbiome Project 和MetaHIT,这些研究获得了大量的临床数据,并使用先进的算法,联系微生物特征与临床状态,以期探明微生物与人体生理状态之间的联系。研究方法 微生物研究的方法越来越多样化,这些方法包括微生物识别(区系调查)、与人类相关的微生物群落分析以及微生物相关的基因方法(如宏基因组学)。 同时也对RNAs、蛋白质和代谢物质等进行研究,这些也可以为人体微生物学研究提供具有参考价值的数据,
3、尤其是将它们与区系调查和宏基因组数据进行结合分析。综述主要内容及意义主要内容 主要叙述以DNA为基础的分子学研究方法。目的 在微生物研究的实验设计和分析工具的使用以及当实验者进行研究调查时涉及到微生物方面时可以提供指导。 正如人类基因组测序能帮助我们分析个体基因如何保护,或者干扰机体一样,人体微生物组的研究也能用于解析人类健康的风险。人体微生物分析流程一一 以以DNA为基础的微生物研究为基础的微生物研究 DNA为基础的微生物研究通常分为两类。1.特异性扩增方法,其研究集中在一个或少数几个标记基因,并使用这些标记基因揭示微生物的组成和多样性。这种方法优势在于提高了微生物群落中特异性的分辨率。2.
4、 宏基因组策略,由于获得的基因组序列是随机的,有时也会被称为鸟枪宏基因组学,能在微生物群落中具有潜在功能方面研究提供更为丰富的数据,但分辨率较低。两种分析策略的路径二.微生物目标基因的选择微生物目标基因的选择 微生物群落的研究通常会涉及系统发育信息标记基因的特异性扩增, 16S rRNA基因是微生物分子生态学最常用的标记序列。其优点有: 16S rDNA存在所有的活体细胞中。 核糖体基因同时包含了慢进化区域和快进化区域,可以设计广谱PCR引物等。 16S rDNA基因可以覆盖多种标记基因,能在许多基因库中进行比对,如greengenes, SILVA,the Ribosomal Databas
5、e Project 。 因此可通过比较基因之间的序列差异反映不同种类之间的进化。1.通用PCR引物的选择 PCR引物的设定应该考虑以下因素: 生物分类学覆盖的需要 扩增片段产生的系统发育信息的长度 测序平台对片段长度的兼容性 与宿主序列相比,微生物扩增序列的特异性程度 根据分析的需要,使特定区域中分类学上的和系统发育上的信息都要得到反应,如16S rDNA中V6可变区对于全长序列的分类地位反应较低。引物选择对目标基因扩增测序的影响2.真核生物及病毒的扩增真核生物及病毒的扩增 利用高通量分析与人体相关的真核生物和寄生生物是非常有限的,并且难以避免宿主基因的扩增。可能的解决这一问题的方案是通用引物
6、和阻碍寄主序列扩增探针的联合使用。 在人体微生物中,病毒是不可忽视的。多数病毒普遍缺乏一个基因,对病毒基因的完整扩增结果不能作为描述病毒特征的依据。可以使用特定分支的病毒基因来识别病毒的亚型。三.生物样品的处理及生物样品的处理及DNA的提取的提取1.样品采集,这是与人类相关微生物研究的限制步骤,具有争议。它需要人类研究机构的批准以及志愿者的同意,要求抽样过程尽量降低感染几率,同时采取微创刮取法(如胃、肠道的取样)。2.DNA提取,基本步骤有细胞溶解、去除非核酸的大分子物质以及DNA收集。细胞溶解步骤值得注意,溶解的强度可能导致结果偏向特定的分类群体。复杂微生物的溶解可借助多种方法或是采用有效的
7、试剂盒。3. 减少污染 防止外源污染,戴手套,尽量在无菌环境中操作并保证仪器的清洁。使用提取试剂盒可减少污染几率。 样品的存放时间也有一定影响,样品长期储存的影响还没有详尽研究,所以样本采集后最好尽快处理。四.DNA的测序方法 人体微生物的研究多使用16S rDNA为基础的分类分析以及鸟枪法宏基组分析,其中测序方法有多种: capillary (Sanger) sequencing (such as the Applied Biosystems 3730 xl DNA analyser) 焦磷酸测序(such as the Roche 454 Genome Sequencer GS, FLX
8、and FLX Titanium) Illuminas 克隆序列(such as the Illumina GAIIx and HiSeq2000). 各种测序技术的比较1.分类特性研究 最初的分类特性研究基于Sanger测序法,随后依赖于发展起来的高通量测序方法,其特点是深度更广、成本更低以及更短的读取长度。 理论上,在分类应用中,长序列可以产生更高的分辨率。然而,基因片段尽可能在100 bp的基础上时,群落组成的变化才具有代表性地被评估。 在近来的5年中,测序的读取长度从100个碱基到250 个碱基,甚至允许几乎整个长度的测序,但由于目前化学方法的限制,读取长度被限制到600个碱基。 为了
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